Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Bu hemojenik indüksiyon protokolünün genel amacı, uzun süreli kültürde hematopoietik hücreler üreten in vitro hematopoietik öncü hücreler oluşturmak için transkripsiyon faktörü aşırı ekspresyonu yoluyla fare fibroblastlarında gelişimsel bir süreç başlatmaktır. Bu yöntem, hematopoetik programlama alanında, çok soylu ve aşılama yeteneğine sahip iyi niyetli HSC'ler de novo elde etmek için bir protokol geliştirilip geliştirilemeyeceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, minimal bir transkripsiyon faktörleri setinin aşırı ekspresyonu yoluyla, pluripotent bir ara ürün boyunca seyahat gerektirmeyen yeniden programlanmış hücrelerde gelişim sürecinin başlatılabilmesidir.

Fare embriyonik fibroblastlarını veya MEFS'yi kültürledikten ve metin protokolüne göre virüs ürettikten sonra, 6 oyuklu plakaları önceden kaplamak için PBS'de yüzde 0.1 jelatin kullanın. Jelatinin kuyunun tüm alanını kapladığından emin olmak. Plakaları en az 20 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Ardından plakaları çıkarın ve jelatini aspire edin. Kuyu başına 25.000 hücre yoğunluğunda standart DMEM'li plaka MEF'leri ve hücrelerin gece boyunca 37 santigrat derecede yerleşmesine izin verin. 50 mikrolitre M2RTTA ve 12,5 mikrolitre GATA2, GFI1B, CFOS ve ETV6'yı karıştırarak 100 mikrolitrelik bir virüs kokteyli hazırlayın.

Ortamı MEFS'den aspire edin ve mililitre heksadimetrin bromür başına 8 mikrogram ile iki mililitre standart DMEM ekleyin. Daha sonra, her bir MEF kuyucuğunu 15 mikrolitre virüs kokteyli ile aktarın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 16 ila 20 saatlik inkübasyonun ardından, her bir oyuktaki ortamı, mililitre DOX başına bir mikrogram ile desteklenmiş iki mililitre taze standart DMEM ile değiştirin.

Üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Dördüncü günde, hidrokortizon, kök hücre faktörü, MFS ile ilişkili tirozin kinaz üç ligand, interlökin üç, interlökin altı ve DOX ile desteklenmiş hematopoietik kültür ortamını hazırlayın. Daha sonra, ortamı MEF'lerden aspire edin ve hücreleri yıkamak için bir mililitre PBS kullanın.

Daha sonra, PBS'yi aspire ettikten sonra, hücreleri ayırmak ve toplamak için kuyu başına bir mililitre yüzde 0.05 tripsin ekleyin. Hemositometreyi kullanarak, hücreleri sayın, daha sonra beş dakika boyunca 300 kez g'de döndürün ve hücreleri yeniden süspanse etmek için hazırlanmış 12 mililitre hematopoietik ortam kullanın. Daha sonra, jelatin kaplı altı oyuklu plakalar üzerinde oyuk başına 10.000 hücre plakalayın.

Her altı günde bir, kültür süresi boyunca ortamı taze takviye edilmiş hematopoietik kültür ortamı ile değiştirin. Hücreleri metin protokolüne göre analiz edin. Metin protokolüne göre hamile farelerden plasentaları diseksiyon ettikten sonra, dokuyu yıkamak için yüzde 20 FBS ile PBS'de iki ila beş mililitre yüzde 0.2 kollajenaz tip bir kullanın ve beş mililitrelik bir şırıngaya takılan 18 gauge bir iğne kullanarak, dokuyu mekanik olarak ayırın

Plasenta hücrelerini iki ila beş mililitre kollajenaz çözeltisinde 37 santigrat derecede 1.5 saat inkübe edin. Daha sonra, hücreleri mekanik olarak daha da ayırmak için 5 mililitrelik şırıngalara takılan 20 ila 25 gauge iğnelerden birkaç kez geçirin. Ardından, tek hücreli süspansiyonları 70 mikron hücreli süzgeçlerden süzün.

Daha sonra, bir hemositometre kullanarak, hücreleri sayın ve mitotik inaktivasyon için 2.000 santigray voltta ışınlayın. On santimetrelik bir tabağa aşağıdakilerle takviye edilmiş on mililitre hematopoietik kültür ortamı ekleyin. 0,65 mikronluk filtreyi doğrudan tabaktaki kültür ortamının üzerine yerleştirin, bir sıvı-gaz arayüzü oluşturmak için yüzmesine izin verin ve tabağı bir kenara koyun.

Bu videoda daha önce gösterildiği gibi 25. gün transdüksiyonlu MEF'leri ayırın ve transdüksiyonlu MEF'lerin 33.000'ini mitotik olarak inaktive edilmiş plasental agregatların 167.000 hücresi ile karıştırın. Bir agrega oluşturmak için, MEF ve plasental hücre karışımını beş dakika boyunca 300 kez g'de döndürün. Ortamı aspire edin ve peletlenmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için 30 ila 50 mikrolitre standart DMEM kullanın, tek hücreli süspansiyonu 200 mikrolitrelik eğimli olmayan bir pipet ucuna çekin.

Ardından, parafin filmi ile pipet ucunu kapatın. Ardından, tıkalı ucu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve ucun kapalı ucunda bir pelet oluşacak şekilde beş dakika boyunca 300 kez g'de döndürün. Ucu 15 mililitrelik tüpten dikkatlice çıkarın ve bir P200 pipetinin ucuna yerleştirin.

Parafin filmi atın ve hücre peletini kültür ortamı kabında yüzen filtreye ekstrüde edin. Yüzer filtrelerdeki agregaları dört ila beş gün boyunca 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksitte kültürleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, agregaları toplayın, ardından birleştirin ve sindirmek için yüzde 0,5 kollajenaz kullanın.

Ayrışmadan sonra, agregaları yıkamak için yüzde beş FBS ile iki ila beş mililitre PBS kullanın ve beş dakika boyunca 300 kez g'de döndürün. Agregaları FBS, Pen-Strep veya L-glutamin olmadan 500 mikrolitre DMEM'de yeniden süspanse edin. Tüm süspansiyonu, mililitre Tepo başına on nanogram ile takviye edilmiş yüzde bir metilselüloz ortamının üç mililitresine ekleyin ve kabarcık oluşumunu dikkatlice önleyin.

CFU tahlilleri için bu karışımın üç, 35 x on milimetre işlenmemiş kültür kaplarında eşit hacimlerde plaka. Bir kontrol olarak, kültür plasental agregatları ışınladı. Son olarak, hematopoietik kolonileri, yüzde 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede on ila 14 günlük kültürden sonra mikroskop altında manuel olarak sayın.

MEF'lerin HSC'lere yeniden programlanması sürecinde, hücreler burada gösterildiği gibi transkripsiyon faktörleri ile dönüştürülür. Transgen aktivasyonuna başlamak için üç günlük genişleme ve DOX'a maruz kaldıktan sonra, hücreler ayrışır, bölünür ve jelatin kaplı plakalar ve takviye edilmiş hematopoietik ortam üzerinde büyütülür. Kültürde 20. günde, yeniden programlama ortamı ile transdüksiyon sonrası, 34 / H2BGFP MEF'ler, MEF'lerden farklı endotel morfolojisi dahil olmak üzere net morfolojik değişiklikler benimser.

35. güne kadar daha fazla kültür, hematopoietik belirteçler Sca1 ve CD45 için GFP pozitif ve boyama pozitif olan endotel benzeri ara ürünlerden ortaya çıkan birkaç yuvarlak hematopoietik benzeri hücre ile sonuçlanır. Daha ileri kültür, insan CD34 raportörünün ekspresyonunu korurken CD45 eksprese eden hücrelerle sonuçlanır. Plasental agregasyon üzerine, kültür hücreleri klonojenik potansiyeli benimser ve çeşitli hematopoietik morfolojiler ve blast benzeri hücreler içeren metilselülozda koloniler oluşturur.

Bu prosedürü denerken, karışmamak için her bölümü yavaş yapmayı unutmamak önemlidir. Herhangi bir hatayı, yeniden programlamaya başladıktan haftalar sonrasına kadar fark etmek zor olacaktır. Bu prosedürü takiben, parke taşı oluşturan hücre tahlilleri ve uzun süreli kültür başlatan hücre tahlilleri gibi diğer yöntemler, türetilmiş hücrelerin fonksiyonel tahlillerde gösterildiği gibi hematopoietik fonksiyona gerçekten sahip olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Geliştirildikten sonra bu teknik, hematopoetik kök hücre programlama alanındaki araştırmacıların kan, endotel ve diğer hücre tiplerinde diğer yeniden programlama stratejilerini ve optimizasyon protokollerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, fare fibroblastlarında hemojenik bir programın nasıl indükleneceğini, transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonunu ve türetilmiş hücrenin işlevsel olarak nasıl test edileceğini iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.