準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達

この手順の全体的な目標は、シンクロトロンおよびX線フリー電子レーザー源での連続結晶学データ収集のために、脂質立方晶相の膜タンパク質結晶のサンプルを調製することです。この方法は、膜タンパク質の構造生物学の分野における重要な問題、例えば、膜を横切る輸送や単一形質導入などの質問に答えるのに役立つはずです。この技術の主な利点は、サンプル消費量を最小限に抑え、放射線損傷を無視できる程度に、天然の脂質環境で膜タンパク質の構造決定が可能になることです。

脂質立方相は粘性のあるゲル状の材料であり、特別なツールと事前の経験がなければ取り扱いが難しいため、この方法に不慣れな個人は苦労するでしょう。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、シリンジ番号1および2番を使用して、Lipidic Cubic Phase(LCP)の膜タンパク質の再構成から開始します。透明で均質なLCPが形成されたら、サンプル全体をシリンジ番号2に移します。

シリンジNo.1を取り外し、カプラーをシリンジNo.2に接続したままにします。取り外し可能な針を、シリンジ番号3と呼ばれる別の100マイクロリットルの清潔な注射器に接続します。約70マイクロリットルの沈殿剤溶液をその中に吸引します。

テフロン球形をシリンジの中に入れたまま、シリンジ番号3から針を外します。シリンジ番号2と番号3をカプラーで接続し、テフロンスフェルールが両方のシリンジに正しく配置されていることを確認します。カプラーを慎重に所定の位置にしっかりとねじ込みます。

結合されたシリンジを垂直に向け、シリンジ番号 2 を底にして、タンパク質を含んだ LCP サンプルをシリンジ番号 2 からシリンジ番号 3 にゆっくりと着実に注入します。注入された LCP の量は、シリンジ番号 3 の初期沈殿物量の約 1/10 になります。両方のシリンジの目盛りの読み取り値で容量を確認します。

次に、シリンジ番号2を取り外してください。現在、カプラーは、沈殿剤溶液に浸されたサンプルを含むシリンジ番号3にのみ接続されています。パラフィルムを使用して、プランジャーとシリンジの界面、カプラーの開口端、ニードルナットを含むシリンジ番号3を完全にシールします。

このステップでのシーリングが不完全な場合、沈殿物の状態が変化し、サンプルが脱水する可能性があります。タンパク質を含んだLCPサンプルの注入ステップを繰り返して、合計約50マイクロリットルのLCPサンプルを利用して、さらに6つのシリンジで結晶化を設定します。密封されたシリンジは、サンプルの脱水から保護するために水で事前に浸された1つまたは2つの繊維を含まないクリーニングティッシュを備えたプラスチック製の密封可能なバッグに保管してください。

バッグを密封し、結晶成長中はシリンジを摂氏20度のインキュベーターに保管します。結晶検出のためには、インキュベーターからシリンジを取り外し、交差偏光を用いた実体顕微鏡下で12〜24時間ごとにシリンジ内で直接LCPサンプルを放出します。結晶は、密集した光沢のある粒子として、または結晶サイズが小さい場合は、LCPフィラメントからの均一な輝きとして識別します。

密封された注射器を袋に戻し、将来の使用のために摂氏20度で保管します。脂質滴定ステップは、余分な沈殿液を吸収し、X線フリー電子レーザービームへの注入時に脂質が凍結するのを防ぐために必要です。データ収集開始の約1時間前に、サンプルの入ったシリンジを摂氏20度のインキュベーターから取り出します。

サンプル固め用のシリンジは、類似した結晶外観と結晶化条件の類似性に基づいて2〜4個選択してください。選択したシリンジからパラフィルムシールを慎重に取り外します。シリンジカプラーを取り外し、最初に選択したシリンジにきれいな取り外し可能な針を取り付けます。

プランジャーをゆっくりと前方に押して、沈殿物を針を通して微量遠心チューブに絞り出します。このステップでは注意してください。プランジャーに高圧を加えると、結晶を含んだLCPの一部が沈殿剤溶液とともに排出され、サンプルの一部または完全な損失につながる可能性があるためです。沈殿物のほとんどが除去され、LCPが針の入り口に蓄積したら、プランジャーを停止します。

選択した他のシリンジに対してこのプロセスを実行します。得られたLCPサンプルを統合するには、2つのシリンジをクリーンなカプラーで接続します。1つのシリンジのプランジャーを押し下げて、サンプル全体を1つのシリンジから別のシリンジに移します。

空のシリンジを外します。この手順を繰り返して、結晶を含むすべてのLCP材料を1つのシリンジに統合します。沈殿物をできるだけ取り除きます。

約5マイクロリットルの7.9 MAGまたは元の短鎖MAG宿主脂質を空のシリンジに加えます。このシリンジをシリンジカプラーを介して固結サンプルとシリンジに接続し、シリンジプランジャーを交互に押し下げて混合します。すべての残留溶液が吸収され、均一で透明なLCPが形成されるまで、このプロセスを繰り返します。

混合LCPサンプル全体を1つのシリンジに移し、空のシリンジを外します。LCPインジェクターローディングニードルを、固結したサンプルを入れたシリンジに取り付けます。LCPサンプルの約1マイクロリットルをスライドガラス上に慎重に排出し、ガラスカバースリップで覆います。

カバースリップをそっと押して、サンプルを挟みます。LCPサンプルの画像は、実体顕微鏡下で、明視野照明と交差偏光子を使用して、可能な限り高い倍率で撮影します。可能であれば、UV蛍光顕微鏡とイメージャーを使用して追加の画像を撮影し、サンプル中のタンパク質微結晶の存在を確認します。

結晶のサイズと密度を推定します。データ収集実験の理想的な結晶密度は、結晶サイズ、X線ビームの直径、およびLCPストリームの直径に依存し、約10〜40%の結晶ヒット率をもたらすはずです最後に、LCPインジェクターをロードし、LCPシリアルフェムト秒結晶構造解析、またはLCP SFXデータ収集を実行します。 テキストプロトコルで説明されているとおりです。ここに示されているのは、エルゴタミンと複合体を形成したセロトニン受容体の微結晶を明視野顕微鏡モードで画像化し、交差偏光顕微鏡モードで画像化したものです。

セロトニン受容体エルゴタミン複合体の構造は、LCP SFXアプローチによって得られた。ここに示されているのは、交差偏光顕微鏡モードを使用してイメージングされた、シクロパミンと複合体の平滑剤受容体の微結晶です。受容体シクロパミン複合体の構造は、LCP SFXアプローチによって得られた。

この手順をマスターすると、適切に実行すれば、この手順は2時間未満で完了できます。この方法は、膜タンパク質ターゲットの構造に関する洞察を得ることができますが、わずかな変更を加えるだけで、タンパク質にも適用できます。この手法の意味するところは、創薬にも及びます。なぜなら、高分解能構造は、標準的なリグナンタンパク質相互作用から優れたテンプレートを提供し、より効率的な薬物の設計に役立つからです。