Name: Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS __ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez la méthode RaPID pour isoler des ARN spécifiques et leurs protéines associées in vivo dans des levures. Cette technique permet d'identifier de nouvelles protéines liées à l'ARN et d'étudier la régulation de l'ARN.

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Nous remercions le Professeur Jeff Gerst et Boris Slobodin pour leurs conseils utiles pour la mise en place du protocole RaPID et en fournissant les plasmides nécessaires. Nous remercions également le Dr Avigail Atir-Lande pour son aide dans l&#39;établissement de ce protocole et le Dr Tamar Ziv du Smoler Proteomics Centre pour son aide dans l&#39;analyse LC-MS / MS. Nous remercions le Professeur TG Kinzy (Rutgers) pour l&#39;anticorps YEF3. Ce travail a été soutenu par la subvention 2011013 de la Fondation binationale Science.

Remarque: Insérez une séquence composée de 12 MS2 sites de liaison (boucles MS2; MS2L) dans le locus génomique désiré, habituellement entre le cadre de lecture ouvert (ORF) et 3 &#39;UTR. Un protocole détaillé pour cette intégration est prévue ailleurs 22. Vérifier une insertion correcte et à l&#39; expression par PCR, analyse de Northern ou par RT-PCR 20,23. Il est important de vérifier que l&#39;intégration ne sont pas intervenus avec la synthèse du 3&#39;UTR. En outre, un MS2-CP plasmide exprimant fusionné à SBP sous l&#39;expression d&#39;un promoteur inductible (depletion de methionine) devrait également être introduit dans les cellules 24. Une souche identique, à l&#39;exception des boucles de MS12 introduit, doit être utilisé en tant que contrôle pour la détection des signaux non spécifiques. 1. RaPID Purification <ol><li> Cultiver 500 ml de cellules de levure ( en utilisant 250-1,000 ml de cellules de levure en fonction du niveau du gène d&#39;intérêt de l&#39; expression) exprimant l&#39; ARNm MS2 marqués 20 etMS2-CP-GFP-SBP protéine de fusion 24 à OD 600 de 0,8 à 1,0 à 30 ° C dans le milieu de croissance approprié (par exemple, synthétique dextrose (SD) milieu sélectif). </li><li> Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 4 min à température ambiante et jeter le surnageant. </li><li> Laver les cellules dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) centrifuger comme précédemment (étape 1.2), remettre en suspension dans un volume égal (étape 1.1) de SD sans méthionine et laisser incuber pendant 45-60 min à 30 ° C pour induire l&#39; expression de la MS2 -CP-GFP-SBP protéine de fusion. Remarque: plus long temps d&#39;induction peut provoquer une agrégation de la GFP. </li><li> Mettre de côté 10 ml de cellules et extraire l&#39; ARN à partir de cet échantillon en utilisant la méthode simple &quot;de phénol chaud&quot; 25. Attention: Phénol est très toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité. Note: Cet ARN est une bonne référence pour la qualité de l&#39; ARN isolé (figure 1A). </li><li> Pour 500 ml de cellules, ajouter 1,35 ml 37% de formaldéhyde à une c finaleoncentration de 0,1% pour réticuler les complexes ARN-protéine. Continuer l&#39; incubation à 30 ° C pendant 10 min. Attention: Formaldéhyde est très toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité. </li><li> Ajouter 26,5 ml de 2,5 M de glycine à une concentration finale de 0,125 M et on incube pendant 3 minutes pour arrêter la réticulation. De cette étape, tout mettre sur la glace pour minimiser la dégradation de l&#39;ARN. </li><li> Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 4 min à 4 ° C et lavage avec 45 ml froid 1x PBS. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon de lyse RaPID par 100 ml de culture cellulaire initiale. </li><li> Diviser en aliquotes de 500 pi dans des tubes de microcentrifugation bouchons à vis et ajoutez ~ 400 mg de perles de verre réfrigéré à chaque aliquote (environ 0,2 ml de plein tube PCR). </li><li> Lyse des cellules dans un cordon batteur pendant 3 min. Immédiatement mettre le lysat sur la glace. Remarque: la lyse des cellules de presse RNases cellulaires, qui sont la principale cause de la dégradation de l&#39;ARN. tampon RaPID Lysis contient une forte concentration de RNase INHIexpo-, tels que l&#39;héparine non spécifique de l&#39;inhibiteur de RNase et d&#39;inhibiteurs spécifiques. Travailler rapidement et garder tout froid est également recommandé. </li><li> Transférer le lysat à de nouveaux tubes. Percer un petit trou dans le fond de chaque tube de centrifugeuse avec une aiguille chaude (0,8 mm x 40 mm) et placez les tubes de microcentrifugation au-dessus des tubes de 15 ml. Utilisez la tête d&#39;une seringue de 5 ml d&#39;adaptateur entre les tubes de microcentrifugation et les tubes de 15 ml. Centrifuger l&#39;assemblage de tubes à 3000 xg pendant 1 min à 4 o C. </li><li> Transférer l&#39;écoulement du tube de 15 ml dans un nouveau tube de 1,5 ml et on centrifuge à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> surnageants Piscine de tous les tubes de 1,5 ml dans un seul tube de 15 ml, et mis de côté 1/50 et 1/100 volume du lysat pour l&#39;ARN et de l&#39;isolement de la protéine, respectivement. Note: Ceux - ci serviront les échantillons &quot;d&#39;entrée&quot; pour une analyse ultérieure (Figure 1). </li><li> Ajouter 300 pg d&#39;avidine par 500 ml de iculture de levure et incuber pendant préside d&#39; abord 30 minutes (ce qui peut être réduit à 10 min) à 4 ° C sous roulement constant (10 rpm). Remarque: les blocs avidine biotine et protéines biotinylées de se lier aux billes de streptavidine. </li><li> Pré-laver les billes de streptavidine avant l&#39;incubation avec le lysat cellulaire. <ol><li> Transférer environ 300 pi de la streptavidine perles suspension à un tube de 1,5 ml et retirer le surnageant supérieur. Cela se traduira par 250 ul de billes. Laver les billes deux fois avec 1 ml de tampon de lyse rapide. Centrifuger les billes de streptavidine à 660 g pendant 2 min à 4 ° C entre chaque étape. </li><li> Bloquer les billes par incubation pendant 1 heure avec 0,5 ml de tampon de lyse rapide, 0,5 ml de 10 mg / ml de BSA et 10 ul de 10 mg / ml d&#39;ARNt de levure. Les perles peuvent être laissées O / N dans une solution de blocage à 4 ° C avec rotation si nécessaire. </li><li> Laver deux fois avec 1 ml de tampon de lyse rapide. Nota: Les billes magnétiques peuvent également être utilisés pour réduire le temps et background. Ceux-ci, cependant, ont une capacité inférieure à celle des billes de sépharose. </li></ol></li><li> Ajouter 250 ul des billes de streptavidine prélavés au lysat contenant de l&#39;avidine (étape 1.14) et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec une rotation constante (10 rpm). Remarque: Ce temps d&#39;incubation est un compromis entre la fourniture de temps de liaison suffisante et en minimisant les chances de dégradation de l&#39;ARN. </li><li> Centrifuger à 660 g pendant 2 min à 4 ° C pour effacer les billes de streptavidine et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml. Mettez de côté 1/50 et 1/100 volume du lysat pour l&#39;ARN et de protéines d&#39;isolement, respectivement. Remarque: Ce seront les échantillons &quot;non consolidé&quot;. </li><li> Laver les billes avec 1 ml de tampon Lysis RaPID, secouer doucement, transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml, et centrifuger comme dans l&#39;étape 1.17. Répétez cette étape trois fois. </li><li> Laver les billes avec 1 ml de tampon RaPID Wash, et cette fois-rotation (10 rpm) pendant 5 min à 4 ° C. Répéter deux fois cette étape. </li&gt; <li> Laver les billes avec 1 ml de 1 x PBS et centrifugation comme ci-dessus. </li><li> Laver les billes à nouveau avec 120 ul de PBS 1x. Centrifugeuse comme ci-dessus, et prendre la totalité du surnageant pour l&#39;ARN et l&#39;extraction des protéines que l&#39;échantillon &quot;Wash&quot;. Note: Ce dernier échantillon de lavage indiquera la rigueur des lavages et devrait être du même volume que l&#39;échantillon d&#39;élution. Cela simplifiera le traitement et le chargement dans des essais ultérieurs. </li><li> Éluer l&#39;ARN et des protéines associées à ARN de la colonne, ajouter 120 pl de 6 mM de biotine dans 1 x PBS et on incube pendant 45 min à 4 ° C avec une rotation constante (10 rpm). </li><li> Centrifuger les perles comme ci-dessus et le transfert du matériel élue dans un nouveau tube de 1,5 ml. Spin l&#39;échantillon élue à nouveau et transférer la phase supérieure dans un nouveau tube de 1,5 ml pour assurer qu&#39;aucun report de perles. </li><li> Prélever des échantillons pour l&#39;ARN ou l&#39;extraction des protéines. Remarque: Le volume prélevé doit dépendre de l&#39;essai et le niveau d&#39;expression de l&#39;ARN ou protéine d&#39;intérêt suivant. À titre indicatif, pour l&#39; analyse du Nord 26, prendre 80% de l&#39;échantillon, pour Western blot 23,27 ou RT-PCR 28, prendre 20%, et pour la spectrométrie de masse 29 pour découvrir de nouvelles protéines, prendre la totalité de l&#39; échantillon. </li></ol> 2. Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Ajouter un volume égal de 2x Réticulation Reversal tampon et incuber pendant 45 min à 65 ° C. Continuer directement pour l&#39;extraction de l&#39;ARN. Remarque: Le Réticulation Reversal Buffer contient de l&#39; acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), ce qui améliore considérablement l&#39; extraction d&#39;ARN 20. </li><li> Utilisez le standard au phénol: méthode de chloroforme 26 pour extraire l&#39; ARN à partir de la &quot;entrée&quot; et des échantillons &quot;non liés&quot; (étapes 1.13 et 1.17). Note: Ces échantillons contiennent une grande quantité de l&#39;héparine inhibiteur de RNase, qui peut inhiber la suite inverse Transcriptase- (RT) des essais utilisant (par exemple, RT-PCR), par conséquent, LiCl précipitations 30 est conseillé de l&#39; enlever. Le &quot;wash &quot;et&quot; &quot;échantillons d&#39;élution (étapes 1.21 et 1.24) contiennent de faibles quantités d&#39;ARN et sont précipités à travers les étapes suivantes. </li><li> Ajouter un volume égal de 8M guanidinium-HCl (GuHCl) et deux volumes d&#39;éthanol à 100% pour le «lavage» et «échantillons d&#39;élution&quot;. Incuber à -80 ° C pendant au moins 2 heures. Remarque: guanidinium va efficacement dénaturer les protéines, et ainsi inhiber les RNases et protéases dans l&#39;échantillon. </li><li> Centrifuger à 20 000 x g, 4 ° C pendant 30 minutes et éliminer le surnageant. Laver le culot avec de l&#39;éthanol à 80% froid et centrifuger de nouveau à 20 000 x g, 4 ° C pendant 15 min. </li><li> Dissoudre le culot d&#39;ARN dans 400 ul de RNase eau libre et précipiter à nouveau pour enlever tout GuHCl restes ou d&#39;autres contaminants. Ajouter 40 ul d&#39;acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 800 ul d&#39;éthanol à 100%, on incube à -20 ° C pendant au moins 1 h. </li><li> Centrifugeuse et laver comme à l&#39;étape 2.4 et de supprimer tous les éthanol avec une pointe de 10 pi. Reprendre le pell ARNet dans 10 ul d&#39;eau libre de RNase. Prendre des précautions supplémentaires comme le culot d&#39;ARN est généralement pas visible. Nota: Les échantillons peuvent être utilisés pour une analyse de Northern , comme décrit dans 23 (figure 1). </li></ol> 3. Protéines Préparation de Western blot ou analyse de spectrométrie de masse <ol><li> Ajouter 1/3 volume de tampon d&#39;échantillon Laemmli 4x (Pf) pour les échantillons de protéines et incuber 45 min à 65 ° C pour inverser la réticulation de l&#39;ARN et des protéines. Note: Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C. </li><li> Les protéines sur un gel de polyacrylamide - SDS (SDS-PAGE) 31. Ajuster le pourcentage de gel en fonction de la taille des protéines à analyser. Remarque: gel d&#39;acrylamide 10% donne une large gamme de séparation et est bonne en première approximation. </li><li> Transfert des protéines sur la membrane comme dans l&#39;analyse par immunoblot standard 27 pour le contrôle de l&#39; efficacité d&#39; isolement (figure 1C). Colorer soit avec le bleu de Coomassie R250 ou argent tache avant l&#39;analyse par spectrométrie de masse. Remarque: la tache d&#39; argent est le choix préféré car il est plus sensible et permet une meilleure détection (figure 1B). La coloration peut être réalisée soit avec des solutions préparées manuellement ou kits commerciaux. Le temps d&#39;incubation du gel dans la solution finale de colorant doit être déterminée expérimentalement. incubation longue peut révéler des protéines de faible abondance, mais peut causer des protéines fortement exprimés tels que MS2-CP-SBP-GFP pour être plus colorées et peut masquer des protéines environnantes dans leur voisinage. De plus, un bruit de fond élevé peut se produire. Suivez la réaction avec soin, et ajouter la solution d&#39;arrêt au moment opportun. </li><li> Découpez des bandes du gel et de les transférer à tubes de 1,5 ml. Conserver les échantillons à -20 ° C, ou envoient pour l&#39; extraction de la protéine et digestion par la trypsine suivie d&#39; une analyse LC-MS / MS 32. </li><li> Comme autre approche protéomique pour exclure l&#39;étape de séparation sur gel, la digestion matériau élue à partir de l&#39;étape de manière à 1,24lution à l&#39; aide de la trypsine et soumises à une analyse LC-MS / MS 33. Remarque: Omettre la séparation SDS-PAGE simplifie le protocole et augmente le rendement. Cependant, les échantillons peuvent contenir des traces de détergent NP-40, qui inhibe l&#39;analyse par spectrométrie de masse. Pour surmonter ce problème, procédez comme suit: <ol><li> Exécutez la protéine sur SDS-PAGE 31 10 - 15 min. </li><li> Découper la partie entière de la voie ( à savoir où se trouvent les protéines). Remarque: L&#39;échantillon de protéine pourrait inclure une quantité importante de la protéine MS2-CP-SBP qui peuvent masquer les signaux de protéines de faible abondance. </li></ol></li></ol>

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<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li>
<li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC+yeast%3A+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Diverses méthodes utilisent l&#39;isolement des ARNm spécifiques pour identifier leurs protéines associées 11,34 35. Ces méthodes sont applicables in vitro et in vivo des stratégies pour sonder les interactions ARN-protéine. Incuber les méthodes in vitro avec l&#39; ARN transcrit de manière exogène lysat cellulaire pour capturer RBP et isoler les complexes RNP 36,37. Une approche efficace de ce type a été présenté récemment, ce qui a permis l&#39;identification...

Protéines liant l&#39;ARN (RBP) représentent environ 10% de S. protéines cerevisiae 1,2 et environ 15% de protéines de mammifères 3-5. Ils sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le traitement de l&#39;ARNm post-transcriptionnelle et de régulation, la traduction, la biogenèse des ribosomes, ARNt aminoacylation et modification, remodelage de la chromatine, et plus encore. Un sous - groupe important de la RBP est les protéines d&#39;ARNm de liaison (mRNP) 6,7. Au cours de l&#39; ARNm maturation, différentes RBP lient la transcription et la médiation de son traitement nucléaire, l&#39; exportation hors du noyau, la localisation cellulaire, la traduction et la dégradation 6-8. Ainsi, l&#39;ensemble distinct de pratiques commerciales restrictives liées à une transcription particulière à tout point de temps détermine son traitement et, finalement, son sort. L&#39;identification des pratiques commerciales restrictives associées à un ARNm pourrait améliorer considérablement notre compréhension des processus qui sous-tendent leur régulation post-transcriptionnelle. Diverse génétique,, Les méthodes bio - informatiques biochimiques et microscopiques ont été utilisées pour identifier des protéines impliquées dans la régulation de l&#39; ARNm (revu dans 9-11). Cependant, seulement quelques-unes de ces méthodes ne permettent l&#39;identification de protéines associées à un ARNm cible particulier. Il est à noter la levure Trois système hybride (Y3H), qui utilise l&#39;ARNm d&#39;intérêt comme appât pour cribler une banque d&#39;expression dans les cellules de levure. Les clones positifs sont généralement observés à travers une expression de sélection de croissance ou reporter 12-14. Le principal avantage de cette méthode est le grand nombre de protéines qui peuvent être scannés dans un environnement cellulaire et la capacité de mesurer la force de l&#39;interaction ARN-protéine. Les inconvénients comprennent le nombre relativement élevé de résultats faussement positifs en raison de la liaison non spécifique, et le potentiel élevé de résultats faussement négatifs dus, en partie, à repliement de la proie de protéine de fusion ou l&#39;ARN appât. Une alternative à l&#39;approche génétique est purifi affinitécation de l&#39;ARN avec ses protéines associées. Poly A contenant des ARNm peut être isolé en utilisant des colonnes d&#39;oligo dT et de leurs protéines associées sont détectées par spectrométrie de masse. L&#39;interaction ARN-protéine est conservée dans son contexte cellulaire par réticulation, ce qui rend à courte portée des liaisons covalentes. L&#39;utilisation de la colonne oligo dT donne une vue globale de l&#39;ensemble du protéome qui est associé à une poly A-ARNm contenant 3,5,15. Toutefois, cela ne constitue pas une liste des protéines qui sont associées à un ARNm particulier. Très peu de méthodes sont disponibles pour accomplir une telle identification. La méthode PAIRE implique la transfection d&#39;acide nucléique avec la complémentarité à l&#39;ARNm cible 16,17. L&#39;acide nucléique est également attaché à un peptide, ce qui permet de réticuler RBP à proximité immédiate du site d&#39;interaction. Après réticulation, l&#39;acide RBP-peptide-nucléique peut être isolé et soumis à une analyse protéomique. Récemment, une méthodologie fondée sur aptamère étaitappliquée avec succès à des extraits de lignées cellulaires de mammifères 18. Un aptamère d&#39;ARN avec une meilleure affinité pour la streptavidine a été développée et fusionnée à une séquence d&#39;intérêt (élément riche en AU (ARE) dans ce cas). L&#39;aptamère-ARE L&#39;ARN a été fixé à des billes de streptavidine et on le mélange avec le lysat cellulaire. Les protéines qui est associée à la séquence sont ont été purifiés et identifiés par spectrométrie de masse (MS). Bien que cette méthode a détecté des associations qui se produisent en dehors des paramètres cellulaires ( par exemple, in vitro), il est susceptible d&#39;être modifiée ultérieurement , de manière à introduire les aptamères dans le génome et permettre ainsi l&#39;isolement des protéines associées à l&#39;ARNm tandis que dans le milieu cellulaire ( par exemple in vivo). Dans la levure, où les manipulations génétiques sont bien établies, la méthode RaPID (développé dans le laboratoire du professeur Jeff Gerst) fournit une vue des associations in vivo 19. RaPID combine la MS2- spécifique et forte liaison de la protéine d&#39;enveloppe de MS2 (CP) à la séquence d&#39;ARN de MS2 et du domaine de liaison à la streptavidine (SBP) à la streptavidine billes conjuguées. Cela permet une purification efficace des ARNm MS2-marqués par des billes de streptavidine. En outre, l&#39;expression de 12 copies de MS2 boucles permet jusqu&#39;à six MS2-CPs se lier simultanément à l&#39;ARN et d&#39;accroître l&#39;efficacité de son isolement. Ce protocole a donc été proposé pour permettre l&#39;identification de nouvelles protéines d&#39;ARNm associé à la fois les échantillons éluées sont soumises à une analyse protéomique par spectrométrie de masse. Nous avons récemment utilisé RaPID pour identifier de nouvelles protéines associées à la levure PMP1 ARNm 20. PMP1 ARNm a été montré précédemment à être associée à la membrane du RE et de sa région 3 &#39;non traduite (UTR) a été trouvé pour être un déterminant majeur dans cette association 21. Ainsi, les pratiques commerciales restrictives qui lient PMP1 3 &#39;UTR sont susceptibles de jouer un rôle important dans sa localisation. Rapide suivie chromatographe liquidey-spectrométrie de masse / spectrométrie de masse (LC-MS / MS) a abouti à l&#39;identification de nombreuses nouvelles protéines qui interagissent avec PMP1 20. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la méthodologie RaPID, des contrôles importants qui doivent être faites, et des conseils techniques qui peuvent améliorer le rendement et la spécificité.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Phénol acide (pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Phénol acide : Chloroforme (5:1, pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phénylméthylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine de soja</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>ribonucléase&nbsp ; Inhibiteur</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0,4-0,6mm de diamètre&nbsp ;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Perles de streptavidine</td><td>GE Healthcare&nbsp ;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levure</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M Tris-HCL pH 6,8, 8 % SDS, 0,4 M DTT, 40 % glycérol, 0,04 % Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Tampon de lyse</td><td></td><td></td> phénolique à chaud <td>10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS&nbsp ;</td></tr><tr><td>3 M Acétate de sodium pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % et 70 % d’éthanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeau</td><td></td><td></td><td></td>sans</tr><tr><td>rase Tampon</td><td></td><td></td> de lyse RaPID <td>20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5 % NP-40, 5 mg/ml d’héparine, 1 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM de phénylméthylsulfonyl fluorure (PMSF), 10 & micro ; g/ml de leupeptine, 10 & micro ; g/ml d’aprotinine, 10 & micro ; g/ml Inhibiteur de la trypsine de soja, 10 & micro ; g/ml de pepstatine, 20 U/ml de DNase I, 100 U/ml de ribonucléase. Inhibiteur.</td></tr><tr>2x tampon <td></td><td></td><td>d’inversion de réticulation</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>de lavage RaPID</td><td>20 mM Tris-HCl pH 7,5,&nbsp ; 300 mM NaCl, 0,5 % NP-40</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>161-0449</td><td>Pour la détection de protéines dans les gels de polyacrylamide</td></tr> : <tr><td>milieu sélectif SD</td><td></td><td></td><td>1,7 g/l Base azotée de levure sans acides aminés et sulfate d’ammonium, 5 g/l Sulfate d’ammonium, 2 % de glucose, 350 mg/l Thréonine, 40 mg/l Méthionine, 40 mg/l Adénine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophane, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A, YEF3)</td><td>Cadeau de Kinzy TG. (École de médecine Robert Wood Johnson de l’UMDNJ)</td><td>1:5 000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3 000</td></tr><tr><td>Anti lapin IgG-HRP conjugué</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10 000</td></tr></tbody></table>

novel protéines __gvirt_np_nn_nnps&lt;__ arn-binding isolation par la méthodologie rapid

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

<classe p='jove_content'>Les protéines de liaison à l’ARN (RBP) jouent un rôle important dans tous les aspects du métabolisme et de la régulation de l’ARN. Leur identification est un défi majeur de la biologie moderne. Seules quelques méthodes in vitro et in vivo permettent d’identifier des RBP associées à un ARNm cible particulier. Cependant, leurs principales limites sont l’identification des RBP dans un environnement non cellulaire (in vitro) ou l’isolement à faible efficacité de l’ARN d’intérêt (in vivo). Une méthodologie de purification et d’identification des protéines de liaison à l’ARN (RaPID) a été conçue pour surmonter ces limitations chez la levure et permettre l’isolement efficace des protéines associées in vivo. Pour ce faire, l’ARN d’intérêt est marqué avec des boucles MS2 et co-exprimé avec une protéine de fusion d’une protéine de liaison à MS2 et d’une protéine de liaison à la streptavidine (SBP). Les cellules sont ensuite soumises à la réticulation et lysées, et les complexes sont isolés par des billes de streptavidine. Les protéines qui co-purifient avec l’ARN marqué peuvent ensuite être déterminées par spectrométrie de masse. Nous avons récemment utilisé ce protocole pour identifier de nouvelles protéines associées à l’ARNm PMP1 associé au RE. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de RaPID et discutons de certaines de ses limites et avantages.

RaPID permet l&#39;isolement d&#39;un ARN cible spécifique avec ses protéines associées. Critique pour son succès est de garder l&#39;ARN intact, autant que possible, de façon à obtenir une quantité suffisante de protéines. Pour déterminer l&#39;efficacité de l&#39; isolement et de la qualité de l&#39; ARN, on effectue une analyse de Northern (figure 1A). analyse Northern a l&#39;avantage de rendre compte directement l&#39;efficacité et la qualité des RaPID. Ainsi, les q...

Les interactions ARN-protéine sont au cœur de nombreux processus cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode in vivo pour isoler un ARN spécifique et identifier de nouvelles protéines qui lui sont associées. Cela pourrait jeter un nouvel éclairage sur la façon dont les ARN sont régulés dans la cellule.

Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler efficacement un ARN spécifique avec les protéines qui lui sont associées in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le métabolisme et la régulation des ARN, telles que : quels sont les protéines spécifiques liées à un transcrit particulier ? Le principal avantage de cette technique réside dans son efficacité élevée d'isolement, ce qui permet d'identifier par la suite des protéines associées à des ARNm particuliers.La méthodologie rapide utilise une souche de levure qui surexprime simultanément un ARNM marqué avec MS2 et une protéine de fusion composée d'une protéine de liaison MS2 et d'une protéine de liaison à la streptavidine. Faire croître 500 millilitres de cellules de levure à 30 degrés Celsius dans un milieu sélectif de dextrose synthétique ou SD jusqu'à une DO600 comprise entre 0,8 et 1,0. Lorsque les cellules sont prêtes, centrifuger à 3000 ×g pendant 4 minutes à température ambiante et éliminer le surnageant.Lavez les cellules dans du PBS et centrifugez à nouveau. Jetez le surnageant et re-suspendez les cellules dans un volume équivalent de SD sans méthionine. Incubez pendant 45 à 60 minutes à 30 degrés Celsius pour induire l'expression de la protéine de fusion.Après 45 à 60 minutes, mettre de côté 10 millilitres des cellules pour l'extraction d'ARN et utiliser les cellules restantes pour une purification rapide. Pour commencer cette procédure, ajouter aux cellules 1,35 millilitre de formaldéhyde à 37 %, afin d'obtenir une concentration finale de 0,1 % pour réticuler les complexes ARN-protéines. Poursuivre l'incubation à 30 degrés Celsius pendant 10 minutes.Pour arrêter la réticulation, ajouter 26,5 millilitres de glycine 2,5 molaire, afin d'obtenir une concentration finale de 0,125 molaire, et incuber à 30 degrés Celsius pendant 3 minutes. À partir de ce moment, garder tout sur de la glace et travailler rapidement pour minimiser la dégradation de l'ARN. Centrifuger les cellules à 3000 fois G pendant 4 minutes à 4 degrés Celsius.Jetez le surnageant, ajoutez 45 millilitres de PBS froid et centrifugez à nouveau. Éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans 5 millilitres de tampon de lyse rapide contenant une concentration élevée d'inhibiteurs d'ARNase. Répartissez la suspension cellulaire en aliquots de 500 microlitres dans des tubes microcentrifugeables à vis et ajoutez environ 400 milligrammes de billes de verre prérefroidies à chaque aliquot.Lysat les cellules dans un homogénéisateur à billes pendant trois minutes. Placer immédiatement le lysat sur de la glace. Transférer le lysat dans de nouvelles tubes microcentrifuge.Coupez le haut d'une seringue de 5 millilitres et placez-la sur un tube vide de 15 millilitres afin de servir d'adaptateur pour les tubes à vis. Utilisez une aiguille chauffée pour percer un petit trou dans le fond de chaque tube, puis placez-les au-dessus des tubes de 15 millilitres adaptés. Faites centrifuger les ensembles de tubes à 3000 ×g pendant une minute à 4 degrés Celsius afin d'éluer le lysat dans les tubes de 15 millilitres.Transférez le flux sortant de chaque tube de 15 millilitres vers un nouveau tube de 1,5 millilitre et centrifugez à 10 000 × g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Rassemblez le surnageant provenant de tous les tubes de 1,5 millilitre dans un seul tube de 15 millilitres. Prélevez un cinquantième et un centième du volume du lysat pour l'isolement de l'ARN et des protéines, respectivement.Commencez la procédure rapide d'isolement des complexes ARN-protéine en ajoutant 300 microgrammes d'avidine au lysat cellulaire. Incubez pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius sous agitation constante. Pendant que le lysat cellulaire est incubé avec l'avidine, pré-lavez les billes de streptavidine, transférez environ 300 microlitres de la suspension de billes de streptavidine dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, centrifugez le mélange, puis retirez le surnageant supérieur, ce qui donnera 250 microlitres de billes.Ajouter 1 millilitre de tampon de lyse rapide aux billes et centrifuger à 660 × g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Éliminer le surnageant et laver à nouveau avec le tampon de lyse rapide. Pour bloquer les billes, ajouter 0,5 millilitre de tampon de lyse rapide, 0,5 millilitre d'albumine sérique de bœuf (BSA) et 10 microlitres d'ARNt de levure, puis incuber pendant 1 heure à 4 degrés Celsius avec une rotation constante.Lavez les billes deux fois avec 1 millilitre de tampon de lyse rapide. Ajoutez 250 microlitres des billes de streptavidine préalablement lavées au lysat contenant de l'avidine et incubez pendant 1 heure à 4 degrés Celsius avec une rotation constante. Cette durée d'incubation constitue un compromis entre un temps de liaison suffisant et la minimisation des risques de dégradation de l'ARN.Après une heure, centrifuger à 660 ×g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius pour clarifier les billes de streptavidine. Transférer le surnageant dans un tube de 15 millilitres. Réserver un volume équivalent à 1/50e et 1/100e du lysat respectivement pour l'isolement de l'ARN et des protéines.Ajouter 1 millilitre de tampon de lyse rapide aux billes. Mélanger par pipetage, transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger à 660 ×g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Laver trois fois supplémentaires avec le tampon de lyse rapide.Après le dernier lavage avec le tampon de lyse rapide, éliminer le surnageant, ajouter 1 millilitre de tampon de lavage rapide et incuber sous agitation pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Centrifuger et effectuer 2 autres lavages avec le tampon de lavage rapide. Laver les billes avec 1 millilitre de PBS et centrifuger comme précédemment.Éliminer le surnageant, ajouter aux billes 120 microlitres de PBS et incuber 5 minutes dans un rouleau. Centrifuger comme précédemment et récupérer tout le surnageant pour l'extraction d'ARN et de protéines en tant qu'échantillon de lavage. Pour éluer l'ARN et les protéines associées à l'ARN, ajouter 120 microlitres de biotine à 6 millimolaire dans du PBS aux billes, puis incuber 45 minutes à 4 degrés Celsius sous agitation constante.Centrifuger les billes et transférer le matériau élué dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Centrifuger à nouveau l'échantillon élué et transférer la phase supérieure dans un nouveau tube de 1,5 millilitre afin de s'assurer qu'aucune bille n'est transférée. Prélever des échantillons pour l'extraction d'ARN ou de protéines.Pour déterminer l'efficacité d'isolement et la qualité de l'ARN, une analyse Northern a été réalisée sur deux ARN marqués, PMP1 et FPR1, provenant de la lyse des cellules fixées, de la lyse rapide des cellules et après élution avec de la biotine. Les ARN ribosomaux ont été détectés par coloration au bromure d'éthidium, et l'absence d'ARN ribosomaux dans l'échantillon d'élution indique la sévérité de la purification.La sévérité et la spécificité de la purification sont davantage démontrées par l'absence de signal d'un ARNm non marqué dans les échantillons d'élution. Le signal apparent dans la piste FPR1, qui n'a pas la taille d'ACT1, provient d'une hybridation antérieure avec la sonde MS2L. Bien que l'ARN d'entrée soit quelque peu plus dégradé par rapport à l'ARN purifié selon le protocole au phénol chaud, une quantité significative d'ARN marqué de pleine longueur est spécifiquement isolée, comme le montre le signal intense dans les fractions d'élution.Les échantillons protéiques peuvent être analysés par électrophorèse SDS-PAGE et coloration argentée avant l'analyse protéomique. La protéine de fusion MS2-CP-GFP-SBP, indiquée par la flèche, démontre une charge protéique équivalente. Les astérisques indiquent des bandes présentant des intensités différentielles qui ont été ultérieurement découpées dans le gel pour une analyse par spectrométrie de masse.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de porter des gants, de s'assurer d'avoir un espace de travail propre, de préparer les solutions avec de l'eau exempte d'ARN, et de travailler rapidement et efficacement afin de réduire la durée du protocole. N'oubliez pas que l'utilisation de réactifs comme le phénol et le formaldéhyde peut être extrêmement dangereuse, et que des précautions telles que le travail sous hotte chimique doivent toujours être prises pendant l'exécution de cette procédure. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de purifier efficacement l'ARN de fayn-tress et de son organite associé.Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'ARN-Seq peuvent être réalisées afin de détecter les ARN qui se lient au transcrit d'intérêt.

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