Infection expérimentale avec Listeria monocytogenes En tant que modèle pour l'étude de l'hôte Réponses Interféron-y

Les objectifs généraux de ce protocole sont d’élever et d’infecter des souris Blacksix C57 avec la souche EGG de Listeria monocytogenes et de mesurer la charge bactérienne, les réponses à l’interféron gamma, ainsi que la survie et la réponse à l’infection par cet agent pathogène. Ce protocole peut aider les chercheurs à dépister les agents ou les gènes qui ont un impact sur les réponses à l’interféron gamma et sur la survie des animaux après une infection bactérienne. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple à mettre en place en laboratoire.

Même pour ceux qui ont peu d’expérience dans la culture des bactéries. Jennifer Ahn, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera également une démonstration de la procédure. Commencez par tremper une pointe de pipette stérile dans du stock de glycérol décongelé à température ambiante de la souche EGG de L monocytogenes.

Et passez immédiatement la pointe d’avant en arrière sur une section d’une perfusion cerveau-cœur ou d’une plaque BHI. C’est la série principale. Tournez la plaque à 90 degrés et faites glisser une nouvelle pointe de pipette à travers la première traînée, en étalant le stock sur le quart suivant de la plaque.

C’est la séquence secondaire. Ensuite, retournez et étalez la traînée secondaire dans un troisième quart de l’assiette pour faire la traînée tertiaire. Maintenant, retournez l’assiette à 37 degrés Celsius, pour une incubation d’une nuit.

Des colonies simples et uniformes doivent être visibles dans la dernière série de stries entre 16 et 24 heures. Lorsque les colonies apparaissent, versez 10 millilitres de bouillon BHI stérile dans un tube stérile ventilé de 50 millilitres et utilisez une pointe de pipette stérile pour transférer une colonie de L monocytogenes de la plaque dans le bouillon. Cultivez le bouillon inoculé dans un incubateur à agitation orbitale pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 225 rotations par minute, jusqu’à ce que la OD600 soit égale à un.

Pour la préparation de l’inoculum expérimental d’infection à L monocytogenes, dans une enceinte de biosécurité, inoculez un tube de milieu BHI avec 100 microlitres de culture de nuit. Après une autre incubation à 37 degrés Celsius, en agitant jusqu’à ce que la OD600 souhaitée soit atteinte, transférez le contenu de la culture dans un tube à centrifuger stérile pour la centrifugation. Et utilisez un aspirateur attaché à une fiole de piège contenant de l’eau de Javel pour aspirer le surnageant.

Lavez la pastille deux fois avec du PBS dans les mêmes conditions de centrifugation. Après le deuxième lavage, remettez les bactéries en suspension dans le PBS et diluez-les à la concentration appropriée. Pour délivrer l’UFC d’intérêt à chaque souris dans un volume de 200 microlitres.

Ensuite, mélangez soigneusement la suspension à l’aide d’une pointe de pipette stérile pour vous assurer que les bactéries sont réparties de manière homogène. Ensuite, aspirez 200 microlitres d’inoculum dans une seringue de sécurité d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 25. Maintenant, écorchez une souris avec la main la moins dominante par la peau lâche autour des épaules.

Et injectez les 200 microlitres de l’inoculum dans le quadrant inférieur de l’abdomen, juste latéralement à la ligne médiane pour éviter la vessie, en utilisant une nouvelle aiguille et une seringue pour chaque animal. Pour mesurer la charge bactérienne maximale de l’infection, le troisième jour après l’infection, retenez les membres d’un animal de laboratoire en position couchée sur une planche de dissection. Et désinfectez la peau avec de l’éthanol à 70 %.

À l’aide de ciseaux stériles et résistants, faites une incision de la poitrine à l’aine. Faites ensuite une incision du milieu de l’aine vers chaque genou et du milieu de la poitrine vers chaque coude. Émoussez, disséquez et réfléchissez la peau, en l’ouvrant avec des aiguilles de calibre 25.

Désinfectez la couche musculaire avec plus de 70 % d’éthanol. Ensuite, à l’aide de ciseaux fins stériles, faites une incision médiane dans la paroi péritonéale. Utilisez des pinces pour saisir le processus xiphoïde.

Faites des incisions dans la paroi péritonéale en commençant par le processus xiphoïde et en vous déplaçant latéralement de chaque côté. En suivant la cage thoracique jusqu’en dessous du diaphragme. Cela révélera le foie.

Ensuite, utilisez des ciseaux stériles pour couper un morceau d’environ 100 milligrammes dans un lobe. Placez le tissu dans un microtube à centrifuger prépesé de 1,5 millilitre contenant 0,2 à 0,3 gramme de billes de verre stériles lavées à l’acide de 1,5 à 2 millimètres. Et utilisez la pince pour écarter doucement les organes du côté gauche de la cavité péritonéale afin de visualiser la rate.

Utilisez la pince pour saisir doucement la rate, en coupant le tissu conjonctif environnant pour libérer l’organe de la cavité péritonéale. Placez la rate dans un tube différent de celui du foie et transférez les tissus au laboratoire dans un récipient étanche contenant de la glace. Agitez les tubes tout en utilisant un homogénéisateur de broyeur à billes pendant trois minutes à une fréquence de 30 hertz.

Ensuite, mettez en place une série de dilutions décuplées des homogénats dans 0,1 % de trident X 100 dans le PBS. Ensuite, à l’aide d’un épandeur stérile, épandez 100 microlitres de chaque homogénat dilué sur une plaque de gélose BHI. Et transférez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour une incubation d’une nuit.

Conservez les plaques qui contiennent jusqu’à 300 colonies par plaque. Comptez les colonies sur chaque assiette. Pour mesurer les réponses CD4 à l’interféron gamma des lymphocytes T CT8, il faut prélever les rates de souris infectées par deux dixièmes dans les quatrièmes d’UFC de l’agent pathogène, comme nous venons de le démontrer.

Transformez la rate en une seule suspension de vie de globules rouges. Et remettre en suspension la pastille à une concentration de quatre fois dix à six cellules par millilitre dans un milieu RPMI complet contenant du FCS. Ensuite, ensemencez un millilitre de cellules par puits dans une plaque de 24 puits avec un volume égal de L monocytogenes décongelé et tué par la chaleur et placez les cultures froides dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Après 20 heures, ajoutez 0,66 microlitre par millilitre d’inhibiteur de transport des protéines dans les puits. Et remettez la plaque dans l’incubateur. Quatre heures plus tard, dans une enceinte de biosécurité, prélevez 500 microlitres de surnageant de culture et congelez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pour la mesure ultérieure de l’interféron gamma par Eliza.

Ensuite, transférez les cellules dans un seul tube stérile de 15 millilitres, en lavant les puits avec du PBS et en regroupant le lavage avec les cellules collectées pour la coloration et l’analyse par cytométrie en flux. Le pic de charge bactérienne se produit dans la rate deux à trois jours après l’infection. Et est considérablement réduit par l’ajout d’un antagoniste PPAR Alpha avant l’infection.

Sept jours après l’infection, la restimulation des lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs de la rate x vivo avec un agent pathogène tué par la chaleur provoque une réponse positive à l’interféron gamma à partir des cellules CD4 positives et CD8 positives, comme détecté par citométrie en flux. Le traitement avec l’antagoniste alpha des PPAR avant l’infection stimule les réponses de l’interféron gamma par les cellules CD4 et CD8. De plus, le traitement par antagoniste des PPAR alpha augmente la plupart des taux de survie après l’infection par la dose DL50 de l’agent pathogène, ce qui illustre la facilité de ce modèle à étudier l’impact de nouveaux médicaments qui modulent les réponses de l’interféron gamma sur la survie des animaux après l’infection.

Une fois maîtrisées, toutes les procédures de ce protocole peuvent générer les données souhaitées en quelques semaines, si elles sont correctement exécutées. La technique peut être adaptée en infectant des souris avec des souches de Listeria monocytogenes qui expriment des antigènes modèles et en utilisant des agents tétramères de classe un et deux spécifiques de ces antigènes. Cela permettra de mesurer l’expansion des lymphocytes T après l’infection.

Après son développement, cette technique est devenue un modèle instrumental pour déchiffrer le rôle de l’interféron gamma dans l’immunité de l’hôte contre les agents pathogènes intracellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et d’infecter des souris C57 blacksix avec listeria monocytogenes. Et pour mesurer la charge de backtrail et les réponses de l’interféron gamma à l’infection.

N’oubliez pas que travailler avec listeria monocytogenes peut être dangereux pour les personnes immunodéprimées telles que les femmes enceintes, les très jeunes ou les personnes âgées. Par conséquent, l’agent pathogène ne doit être manipulé que par des personnes immunocompétentes dans des conditions de niveau de biosécurité deux.