Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, comme la manière dont les canaux ioniques voltage-dépendants individuels contribuent aux fonctions d’un neurone spécifique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de cartographier la fonction des canaux ioniques au niveau sous-cellulaire dans les neurones. Commencez cette procédure en plaçant le cerveau sur une boîte de Pétri de 9 centimètres dont le fond est recouvert d’une couche de SiliGuard.

Ensuite, entourez le cerveau avec du milieu ACSF glucosé glacé. Pour préparer des tranches coronales, effectuez deux coupes afin d’enlever le cervelet et la partie rostrale du cerveau. Appliquez ensuite de la colle cyanoacrylate sur le plateau d'échantillonnage, puis fixez le bloc cérébral sur le plateau de manière à ce que la partie rostrale soit orientée vers le dispositif de découpe.

Ensuite, appliquez quelques gouttes de ACSF au saccharose sur le cerveau et immergez lentement le plateau dans la chambre de découpe. Ajustez ensuite le rasoir à un angle de 15 degrés par rapport au plan horizontal. Découpez des tranches coronales du cerveau d'environ 500 micromètres dans le sens nasal avant d'atteindre la substance noire.

Ensuite, ajustez l'épaisseur pour découper des tranches de 300 micromètres contenant la région d'intérêt. Séparez les tranches du bloc tissulaire à l’aide d’une très fine aiguille de perfusion fixée à une seringue, parallèlement au bord du rasoir. Puis, transférez les tranches dans la chambre de réserve à 34 degrés Celsius pendant une heure.

Dans cette procédure, transférez une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement. Fixez la tranche au fond de la chambre d’enregistrement à l’aide d’un anneau en platine, et assurez-vous que la tranche est de bonne qualité, avec une surface lisse et uniforme. Ensuite, sélectionnez un neurone dont un dendrite s’étend sur une longue distance dans le même plan, et vérifiez que le dendrite d’intérêt peut être suivi jusqu’à un soma bien défini.

Ensuite, remplir la pipette de patch avec la solution pour électrode. Pour réaliser le patch sur le dendrite en mode cellule attachée, identifier et focaliser sur une portion du dendrite. Appliquer une pression positive sur la pipette, puis l'abaisser à l'aide du micromanipulateur.

Ensuite, positionnez la pipette près de la membrane et ajustez la pression afin de créer un petit affaissement. Puis, relâchez progressivement la pression au niveau de l'extrémité de la pipette et effectuez le patch du dendrite, tout en contrôlant la résistance de la pipette. Essayez d'obtenir une résistance d'étanchéité supérieure à un gigaohm, idéalement comprise entre trois et dix gigaohms, pour les enregistrements en configuration cellule-attachée.

Ensuite, retirez la pipette de la membrane de quelques micromètres afin d'éviter toute déformation de la dendrite. Les courants d'action observés ici représentent les potentiels d'action spontanés des neurones de la substance noire. Pour supprimer les courants d'action, ajoutez des bloqueurs des canaux calciques et sodiques au ACSF.

Appliquez ensuite un palier de tension de 90 millivolts, à partir d'un potentiel de maintien de zéro millivolt, afin d'induire le courant cationique activé par hyperpolarisation. À la fin de l'enregistrement, rompez le patch pour obtenir le mode cellule entière. Après cela, retirez lentement et délicatement la micropipette dendritique de la membrane neuronale pour obtenir un patch en configuration « outside-out ».

Pour enregistrer à partir du soma correspondant en mode tout-cellule, localisez le soma correspondant à la dendrite. Abaissez une pipette ayant une résistance comprise entre cinq et dix mégohms, contenant une solution intracellulaire à base de potassium, jusqu'au corps cellulaire. Appliquez ensuite une brève pression négative à l'extrémité de la pipette pour rompre la membrane et ainsi obtenir le mode tout-cellule.

Vérifiez l'identité du neurone en mode courant-clamp en appliquant de longs paliers de courant hyperpolarisants et dépolarisants, et laissez la biocytine provenant de la pipette diffuser le long des dendrites. Après 10 minutes, retirez la pipette pour obtenir un patch en configuration outside-out. Utilisez une série de courts déplacements latéraux vers le haut afin de favoriser la fermeture adéquate de la membrane cellulaire, une fois la pipette au-dessus de la tranche, pour sortir complètement de la chambre d’enregistrement.

Conserver la coupe dans la chambre d’enregistrement pendant 15 minutes supplémentaires dans du ACSF standard afin de permettre l’équilibration de la biocytine et du neurone enregistré. Ensuite, transférer délicatement la coupe dans un flacon en verre brun de 25 millilitres contenant du ACSF standard pour l’histologie. Dans cette procédure, localiser approximativement le neurone marqué de façon fluorescente dans la coupe à l’aide de la fluorescence épiscopique.

Examinez brièvement l'arborisation dendritique des neurones et localisez l'axone et le bourgeon axonal à l'aide d'un objectif 10X. Ensuite, passez au microscope confocal et sélectionnez la diode laser de 488 nanomètres pour exciter le neurone marqué. Suivez l'extension de l'axone et des dendrites selon l'axe Z et enregistrez des images successives afin d'obtenir une pile Z pour l'ensemble de la cellule.

Réglez la résolution de l'axe Z et acquérez les images confocales de la cellule à faible et à forte augmentation. À la fin, ouvrez le fichier image du neurone à l'aide d'un logiciel d'imagerie. Comparez visuellement l'image de projection Z avec une image IR-DGC afin de localiser la position précise de la pipette de patch pendant l'enregistrement électrophysiologique.

On voit ici l'image IR-DGC d'un neurone à dopamine et d'une pipette positionnée sur la dendrite proximale. Le tracé du courant montre la capacité des courants de fuite EN en réponse à une commande de tension de cinq millivolts, en configuration cellule-attachée, avec une résistance de scellement de cinq gigaohms. Un saut de tension hyperpolarisant, à partir d'un potentiel membranaire de zéro millivolt, a induit un courant cationique activé par hyperpolarisation à activation lente.

Le tracé du courant a été inversé et ajusté à l’aide d’une fonction exponentielle unique, donnant une constante de temps de 632 millisecondes. Voici les réponses en tension du soma enregistré en configuration tout-cellule à des impulsions de courant hyperpolarisantes et dépolarisantes d’une seconde, en présence d’inhibiteurs des courants sodique et calcique dépendants de la tension, afin d’éliminer les potentiels d’action durant l’enregistrement en configuration cellule-attachée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée, à condition d’être effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'obtenir un tissu sain et des conditions d'enregistrement stables. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'immunohistochimie, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'identification du neurone enregistré. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la neurophysiologie d'explorer la fonction des propriétés ainsi que le rôle des canaux ioniques activés par le voltage dans les cellules excitables.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment enregistrer et examiner la répartition des courants traversant les canaux ioniques activés par le voltage dans les dendrites.