Субклеточные патч-зажим Recordings от Somatodendritic домена нигральных дофамина нейронами

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, о том, как отдельные потенциал-зависимые ионные каналы влияют на функции конкретного нейрона. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет картировать функции ионных каналов в нейронах на субклеточном уровне. Начните выполнение данной процедуры с размещения мозга в чашке Петри диаметром 9 сантиметров, дно которой покрыто слоем SiliGuard.

Затем поместите мозг в ледяной раствор сахарозы-ACSF. Для подготовки корональных срезов сделайте два разреза, чтобы удалить мозжечок и ростральную часть мозга. Затем нанесите цианоакрилатный клей на лоток для образцов и приклейте блок мозга к лотку так, чтобы ростральная часть была обращена к платформе для нарезки.

Затем нанесите несколько капель сахаросодержащего раствора ACSF на мозг и медленно погрузите лоток в камеру для нарезки. После этого установите лезвие бритвы под углом 15 градусов относительно горизонтальной плоскости. Вырежьте корональные срезы мозга толщиной около 500 micrometers в каудально-назальном направлении до достижения substantia nigra.

Затем отрегулируйте толщину срезов, чтобы получить фрагменты толщиной 300 микрометров, содержащие интересующую область. Отделите срезы от блока ткани с помощью очень тонкой перфузионной иглы, прикрепленной к шприцу, перемещая ее параллельно краю лезвия бритвы. После этого перенесите срезы в резервуар с поддерживающей средой при температуре 34 °C на один час.

В данной процедуре перенесите срез мозга в регистрирующую камеру. Закрепите срез на дне камеры с помощью платинового кольца и убедитесь, что срез качественный, имеет гладкую и ровную поверхность. Затем выберите нейрон с дендритом, который простирается на значительное расстояние в одной плоскости; убедитесь, что этот дендрит можно проследить до четко выраженного сомы.

Затем заполните патч-пипетку электролитным раствором. Чтобы выполнить патч-кламп дендрита в режиме прикрепления пипетки (cell-attached), найдите и сфокусируйтесь на определенном участке дендрита. Подайте положительное давление в пипетку и опустите ее с помощью микроманипулятора.

Затем расположите пипетку близко к мембране и отрегулируйте давление, чтобы создать небольшое углубление. После этого сбросьте давление на кончике пипетки и произведите патч-кламп дендрита, контролируя сопротивление пипетки. Для записей в конфигурации cell-attached стремитесь к достижению сопротивления уплотнения более 1 ГОм, в идеале — от 3 до 10 ГОм.

Затем отведите пипетку от мембраны на несколько микрометров, чтобы избежать деформации дендрита. Наблюдаемые здесь токи действия представляют собой спонтанные потенциалы действия нейронов черной субстанции. Чтобы подавить токи действия, добавьте в ACSF блокаторы кальциевых и натриевых каналов.

Затем примените ступенчатый скачок напряжения 90 мВ от удерживающего потенциала 0 мВ для вызова гиперполяризационного активируемого катионного тока. В конце записи разрушьте мембрану в области патча для перехода в режим целой клетки. После этого медленно и аккуратно извлеките дендритную пипетку из мембраны нейрона, чтобы получить патч с внешней стороной наружу (outside-out patch).

Для проведения регистрации с соответствующего сомы в режиме целого This-клетки (whole-cell mode) найдите сому, соответствующую данному дендриту. Опустите пипетку с сопротивлением от пяти до десяти МОм, заполненную внутриклеточным раствором на основе калия, к телу клетки. Затем создайте кратковременное отрицательное давление на кончике пипетки, чтобы разорвать мембрану и перейти в режим целой клетки.

Проверьте идентичность нейрона в режиме фиксации тока (current-clamp), подавая длительные гиперполяризующие и деполяризующие ступени тока, и дайте биоцитину из пипетки диффундировать по дендритам. Через 10 минут извлеките пипетку, чтобы получить патч типа outside-out. Когда пипетка окажется над срезом, используйте серию коротких боковых движений вверх, чтобы способствовать правильному закрытию клеточной мембраны, и полностью выведите ее из измерительной камеры.

Оставьте срез в регистрирующей камере еще на 15 минут в стандартном ACSF для уравновешивания биоцитина и регистрируемого нейрона. Затем аккуратно перенесите срез в янтарную стеклянную бутыль объемом 25 миллилитров, содержащую стандартный ACSF для гистологии. В ходе этой процедуры примерно определите местоположение флуоресцентно помеченного нейрона в срезе с помощью эпифлуоресценции.

Кратко изучите дендритное дерево нейронов и найдите аксон и аксональный вырост (блеб), используя объектив 10X. Затем переключитесь на конфокальный микроскоп и выберите лазерный диод с длиной волны 488 нанометров для возбуждения меченого нейрона. Проследите за протяжением аксона и дендритов по оси Z и сделайте серию последовательных снимков для получения Z-стека всей клетки.

Отрегулируйте разрешение по оси Z и получите конфокальные изображения клетки при малом и большом увеличении. В завершение откройте файл изображения нейрона в программе для анализа изображений. Визуально сравните изображение Z-проекции с изображением IR-DGC, чтобы определить точное положение патч-пипетки во время электрофизиологической регистрации.

Здесь представлено ИК-ДГК изображение дофаминового нейрона и пипетки на проксимальном дендрите. Кривая тока демонстрирует величину токов утечки EN в ответ на команду изменения напряжения в 5 mV в конфигурации cell-attached при сопротивлении герметизации 5 ГОм. Гиперполяризующая ступень напряжения от мембранного потенциала 0 mV вызвала медленно активируемый гиперполяризационно-активируемый катионный ток.

Текущая кривая была инвертирована и аппроксимирована одной экспоненциальной функцией, что дало постоянную времени 632 миллисекунды. Здесь представлены ответы по напряжению всей клетки, записанные в соме, на односекундные гиперполяризующие и деполяризующие импульсы тока в присутствии блокаторов вольтеж-зависимых натриевых и кальциевых каналов для устранения потенциалов действия во время регистрации в конфигурации patch-clamp (cell-attached). После освоения эта методика может быть выполнена за один день при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении данной процедуры важно стремиться к получению здоровой ткани и обеспечению стабильных условий регистрации. После завершения данной процедуры можно применить другие методы, такие как иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, об идентичности регистрируемого нейрона. После своего появления этот метод открыл исследователям в области нейрофизиологии путь к изучению функций, свойств и роли потенциалзависимых ионных каналов в возбудимых клетках.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как регистрировать и анализировать распределение токов, протекающих через потенциалзависимые ионные каналы в дендритах.