Name: 基于CFSE-试验鼠皮肤树突状细胞的迁移习进引流淋巴结在与感染牛分枝杆菌卡介苗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学习使用CFSE荧光示踪技术追踪小鼠皮肤树突状细胞在卡介苗感染后向引流淋巴结的迁移过程。该方法结合流式细胞术可分析细胞活化状态，为免疫学研究提供重要的可视化实验手段。

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本工作由卡罗林斯卡学院、瑞典研究理事会VR的项目资助（Dnr 2014-2794）以及卡罗林斯卡学院的KID博士资助（全部授予A.G.R）支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

注意：本研究中所示实验使用了 C67BL/6 小鼠。这些动物饲养于瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院 MTC 动物设施的特定无病原体环境中。动物实验遵循瑞典农业委员会、瑞典动物保护局以及卡罗林斯卡学院的相关规定与指导方针，并经斯德哥尔摩北部动物伦理委员会批准。
1. CFSE 储存液的配制与保存
<ol>
	<li>用二甲基亚砜配制5 mM的5-和6-羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）储备液。涡旋混匀。将100 µl分装至无菌的0.5 ml螺口微量离心管中。于-80 °C保存分装液。</li>
</ol>
2. 小鼠
<ol>
	<li>使用8至12周龄的近交系雄性或雌性小鼠。建议使用性别和年龄相匹配的动物。在实验开始前，确保已获得必要的动物伦理许可。</li>
</ol>
3. 使用异氟烷气体麻醉固定动物
<ol>
	<li>在麻醉装置中加入异氟烷。用异氟烷填充10 ml气密玻璃注射器，避免引入气泡。使用提供的管路将注射器与液体入口连接，并推动推杆，直至连接管中的液体明显即将进入蒸发器。 
	注意：不使用时，请勿将异氟烷储存在注射器中。</li>
	<li>在诱导室中使用异氟烷对动物进行麻醉，维持气流速度约为400 - 500 ml/min，异氟烷浓度为3.5%。 
	注意：无气流时，设备无法运行。</li>
	<li>动物进入睡眠状态后，转动麻醉装置上的旋塞阀，使异氟烷气体通向面罩部分。检查面罩是否完好，以防止气体泄漏。气流可维持在400 ml/min，也可选择降低至200 ml/min。将异氟烷浓度降至2.6%。 
	注意：可通过调节气流速度来增强或减弱麻醉效果。</li>
</ol>
4. 卡介苗注射与恢复
<ol>
	<li>在注射前，通过肉眼观察并进行足趾捏压反射测试等方法，确认小鼠在异氟烷麻醉面罩下已完全固定/处于睡眠状态。</li>
	<li>使用配备29 G × ½英寸针头的注射器，在小鼠后足垫接种30 µl含1 × 106 菌落形成单位的Mycobacterium bovis 卡介苗（Bacille Calmette-Guérin, BCG）PBS溶液。 
	注意：分枝杆菌菌液的制备方法在本实验方案的原始描述中已有简要说明3，并在其他文献中有更详细的描述6。BCG也可直接从商业来源获得。作者建议在接种小鼠前，对BCG进行脉冲式超声处理或反复通过注射器以打散菌体聚集体。此处再次提及BCG是因其在该实验方案原始描述中被用作微生物刺激物3，但作者也明确鼓励尝试其他微生物刺激物。</li>
	<li>对对照组小鼠采用上述相同操作，注射PBS溶液。</li>
	<li>注射后密切观察动物，确认其麻醉后恢复良好，并能正常承重于注射侧的后足垫。</li>
</ol>
5. CFSE 注射
<ol>
	<li>CFSE 注射液的制备：
	<ol>
		<li>从 -80 °C 取出一管 5 mM CFSE 储存液，解冻后用 PBS 稀释 10 倍。在将溶液吸入注射器前，充分重悬混匀，以备注射使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CFSE 注射与回收：
	<ol>
		<li>重复第 3 节中动物麻醉的操作步骤。在先前接种过 BCG 或 PBS 的后足垫皮下注射 20 µl 0.5 mM CFSE。 
		注意：CFSE 注射应在计划处死动物的前一天（即 24 小时前）进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 腘窝淋巴结（pLN）的手术切除
注意：建议在整个步骤中使用已灭菌的外科手术器械，并反复用70%乙醇进行去污处理。
<ol>
	<li>处死小鼠。用70%乙醇喷洒动物，并将其仰卧位固定在解剖板上。 
	注意：作者推荐通过颈椎脱位法处死动物。</li>
	<li>在后侧大腿处小心做一纵向切口。使用剪刀和镊子清除肌肉和脂肪组织，暴露出位于膝窝脂肪囊深处的腘淋巴结（pLN），并将其切除。</li>
	<li>将腘淋巴结（pLN）转移至0.5 ml无菌PBS中，置于冰上。</li>
</ol>
7. 从 pLN 制备单细胞悬液
<ol>
	<li>通过置于6孔板（含5 ml PBS或流式细胞分选（FACS）缓冲液（含2%胎牛血清（FCS）、5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和1 mM叠氮化钠））中的70微米细胞滤筛匀浆pLN。使用3 ml注射器的尾端通过滤筛进行匀浆。 
	注意：叠氮化钠具有毒性，应谨慎操作。</li>
	<li>用另外5 ml PBS或FACS缓冲液冲洗滤网，将冲洗液收集至15 ml离心管中，在4 °C、277 × g（1,200 rpm，R = 172 mm）条件下离心5分钟，沉淀细胞。或者，可直接在微量离心管中使用聚丙烯匀浆器对pLNs进行匀浆处理。</li>
	<li>根据沉淀物的大小，将pLN悬液重悬于适当体积的PBS或FACS缓冲液中， 例如，200 - 1,000 µl。使用计数板对每份淋巴结悬液获得的总细胞数进行定量。使用台盼蓝排除死细胞或濒死细胞。</li>
</ol>
8. 细胞染色与流式细胞术
<ol>
	<li>将 1 - 10 × 106 个细胞转移至 5 ml 圆底聚苯乙烯管中。用 FACS 缓冲液洗涤，并在 4 °C 条件下以 277 × g（1,200 rpm，R = 172 mm）离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 50 - 100 µl 抗体混合液中（参见表面染色所用树突状细胞 [DC] 标记物，《材料表》），其中包含 0.5 - 1 µg 抗小鼠 CD16/CD32 抗体（用于阻断非特异性 Fc 介导的相互作用），在冰上孵育 30 - 45 分钟。样品需避光。</li>
	<li>孵育结束后，用 FACS 缓冲液洗涤细胞，并在 4 °C 条件下以 277 × g（1,200 rpm，R = 172 mm）离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞重悬于 50 - 100 µl FACS 缓冲液中。在流式细胞仪上获取数据7-10。 
	注意：关于流式细胞术的优秀综述，我们推荐读者参考以下出版物，这些文献提供了该方法的理论与实践信息。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

树突状细胞（DCs）是一类特殊的抗原呈递细胞，能够通过获取微生物抗原并经淋巴管迁移至引流淋巴结（DLN），从而在机体表面应对微生物侵袭。在引流淋巴结中，DCs以能够驱动初始T细胞应答的方式将抗原呈递给T细胞。因此，DCs从组织向DLN迁移的过程对于理解有效的T细胞应答如何启动具有重要意义。因而，用于检测DC迁移的方法在揭示上述机制方面非常有用。
采用小鼠模型研究皮肤树突状细胞（DC）在卡介苗（BCG）感染后向引流淋巴结（DLN）的迁移过程。BCG 是一种临床上通过皮肤注射接种的活疫苗。在此模型中，将 BCG 注射至后足垫以模拟这种皮肤接种途径。本研究建立并整合了一种简单的检测方法，用于探究皮肤中 BCG 接种部位的 DC 亚群向引流浅表淋巴结（pLN）的迁移情况。该实验方案依赖于在先前接种 BCG 的同一足垫内注射荧光染料 CFSE，24 小时后分离引流 pLN，并通过流式细胞术分析 CFSE 标记细胞的存在。尽管本方案未作描述，但该实验体系中的淋巴结也可制备用于共聚焦显微镜分析，以研究迁移细胞在淋巴结内的定位等迁移过程3。此外，使用 BCG Pasteur 1173P23 和 BCG SSI 133114 均获得了相似的 BCG 诱导皮肤 DC 迁移结果。
CFSE 常用于标记细胞 体外 并追踪这些标记的细胞 体内 细胞转移后 15在本实验方案中，它被用于直接标记皮肤细胞 原位CFSE标记的分子基础与FITC相似，两者均为胺类反应性荧光染料。然而，CFSE在偶联反应中优于FITC，因其可形成极为稳定的羧酰胺键。 16此外，CFSE 具有高度膜通透性，可被动扩散进入细胞。进入细胞后，其形成细胞内胺基（荧光）结合物，并保留在标记的细胞内。 15.
作者开发的基于CFSE的迁移实验能够检测在接种BCG后24小时内从皮肤迁移至引流淋巴结（DLN）的细胞。因此，该方法可在特定时间范围内测量急性迁移过程，并可用于研究不同注射刺激物诱导细胞迁移的能力。此方法不同于经典的FITC皮肤涂抹技术，后者通过皮肤局部应用接触致敏剂来检测累积性迁移事件。因此，基于CFSE的迁移实验可用于鉴定在足垫注射微生物、微生物产物或其他炎性刺激物后，从皮肤迁移至近端淋巴结（pLN）的迁移性树突状细胞（DCs）或其他细胞类型。事实上，已有研究表明中性粒细胞和γ:δ T细胞可在BCG刺激下从皮肤迁移至DLN17,18。实际上，该实验最近还被用于共感染模型中，证明肠道局部的线虫感染可抑制BCG诱导的皮肤树突状细胞向DLN的迁移14。
FITC皮肤涂抹后，由于标记了FITC的树突状细胞在涂抹后4至5天难以检测，因此通常在24至72小时内评估树突状细胞的迁移情况 19. 在本实验中，标记的DCs上的CFSE信号丢失不是问题，因为迁移分析仅限于24小时；其原因为作者希望特异性研究 &#34;过夜&#34; 迁移事件。然而，其他对此检测方法感兴趣的研究者也可探索基于CFSE示踪的更早或更晚时间点。此外，由于CFSE通过注射方式引入，可在任意设定的时间给予。这种灵活性使作者能够评估卡介苗（BCG）感染后第5至第6天之间的树突状细胞迁移情况图2C) 3注射CFSE可能会限制可获取的细胞类型 原位 到标记反应中。例如朗格汉斯细胞（LCs），即 resides 于皮肤最上层表皮的树突状细胞（DCs），在基于CFSE的迁移实验中对BCG的响应迁移能力较差（图3) 3然而，在进行FITC皮肤涂抹时，位于表皮下层即真皮层的树突状细胞（DCs）可被迅速标记，并比朗格汉斯细胞（LCs）更快地迁移至引流淋巴结（DLN）。 20,21这表明，细胞可以在不必然定位于染色溶液涂抹的皮肤层的情况下，仍被荧光染料标记。
作为BCG感染的模型，小鼠耳朵提供了一个 真正 更符合卡介苗（BCG）作为结核病疫苗临床接种途径的皮内注射方式。而足垫注射则可能同时涉及皮内和皮下两种途径。需要指出的是，将卡介苗准确且可重复地递送至真皮层，需要熟练的技术和培训。 22，因此在临床实践中，注射可能并非完全局限于真皮内，而可能是皮下注射或两者兼有。作为接种部位，足垫相比耳部有两个明显优势，值得指出。首先，足垫注射后的免疫反应会集中于引流的 pLN，这有利于对免疫反应的观察。本研究报告的作者发现，pLN 是足垫的主要且首先引流的淋巴结 3有人提出，在注射伊文思蓝后，淋巴液可分别引流至腘窝淋巴结和髂下淋巴结 23然而，就小鼠的耳朵而言，存在不止一个耳部引流淋巴结（DLN），且这些淋巴结可能并非始终存在或易于定位 24后者在研究DLN反应时显然会引入干扰因素。其次，与耳部相比，足垫可接种较大体积的液体（10–50 µl），这不仅减少了对淋巴引流造成显著改变的风险，也避免了操作极小注射体积所带来的技术难题，而后者在接种大量分枝杆菌时尤为突出。在耳部注射时，由于注射体积必须很小（1–10 µl），即使5 µl也可能改变淋巴流动，甚至可能将较大量的注射物质以不受控的方式直接推入DLN。因此，必须充分考虑注射体积的影响，这一点在研究细胞在细菌向淋巴结转运过程中所起作用的实验中尤为重要。在BCG足垫模型中，部分BCG可能在缺乏细胞运输的情况下仍到达DLN。这一推断基于以下观察结果：即使通过局部注射百日咳毒素完全阻断足垫细胞的迁移，仍可在DLN中检测到BCG。 3这是否表明卡介苗（BCG）能够直接进入淋巴管并以真正无细胞的方式到达深部淋巴结，仍有待确定，因为尚不能排除在此情况下，分枝杆菌是因注射体积过大而被动推入淋巴管的。
在耳部或足垫进行免疫接种时，一个实际考虑因素是必须充分固定动物，以确保注射操作能够正确且可重复地进行。本方案中描述了使用异氟烷气体作为动物在足垫注射前的固定方法。异氟烷麻醉的诱导和恢复时间相对较短，因此是一种常用方法；但与其他麻醉剂类似，它会影响动物的生理状态，可能干扰实验结果25。事实上，无论是吸入性还是注射性麻醉剂，都会通过消除自主肌肉运动、降低肌张力以及减少淋巴管节段性收缩，从而减少淋巴液流动26。此外，已有报道称，在麻醉动物中，经足垫过继转移的树突状细胞向引流淋巴结（DLN）迁移的数量减少了5倍27。鉴于上述情况，并且由于麻醉前的操作处理可能比注射本身给动物带来更大的应激——而注射过程迅速且无需恢复期——因此应考虑在不使用麻醉剂的情况下有效固定动物的可能性。若有一种专为足垫注射设计的小鼠固定装置，可使动物迅速进入固定位置，并在30至40秒内完成后肢足垫接种，则可在不改变其生理状态的前提下完成注射，这对于研究细胞经淋巴系统迁移的实验将极为有利。
综上所述，本报告介绍了一种利用特定24小时时间窗监测迁移过程的实验方法，用于追踪皮肤树突状细胞（DCs）向引流淋巴结（DLN）迁移的新方案。这种基于CFSE的迁移实验不仅可以通过流式细胞术进行迁移细胞的检测与分析（如本文详述），也可通过共聚焦显微镜进行观察3。该方法提供了一个灵活的平台，可用于研究多种注射刺激物及其诱导DC迁移的能力；更重要的是，该方法不仅可用于追踪DCs，还可用于在不同实验条件下追踪从皮肤迁移至DLN的其他细胞群体。

位于机体表面的树突状细胞（DC）可感知微生物或其产物，并由此通过淋巴管迁移至引流淋巴结（DLN）1,2。这种迁移对于将微生物抗原转运至DLN以及随后启动针对入侵微生物的免疫应答至关重要。事实上，若阻断DC从感染组织向DLN的迁移，或该迁移过程发生障碍，均可导致T细胞应答受到抑制3-5。因此，设计用于在单细胞水平追踪迁移行为的检测方法，有助于明确特定DC亚群的迁移功能。
关于皮肤树突状细胞（DC）向引流淋巴结（DLN）迁移的研究已有大量数据。这些研究构成了目前对炎症或感染部位树突状细胞迁移认知的主体2。这一点并不令人意外，因为皮肤含有大量树突状细胞，且在实验小鼠中易于进行操作。因此，已发展出多种技术用于评估小鼠树突状细胞从皮肤向引流淋巴结的迁移过程2。其中，FITC皮肤涂抹法是目前应用最为广泛的方法。在该实验中，将荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）溶于丙酮和接触性刺激物的混合液中，涂抹于脱毛或剃毛后的皮肤表面，随后分析引流淋巴结中FITC标记细胞的聚集情况。此外，也可通过向皮肤注射带有荧光标记的纳米或微米颗粒来研究细胞迁移，从而追踪那些在皮肤中吞噬了荧光颗粒的吞噬细胞。另一种方法是插管淋巴管，直接从淋巴液中获取迁移中的树突状细胞，但该技术操作难度较高，尤其在小鼠中更为困难。同时，所获得的树突状细胞数量有限，也成为后续分析的制约因素。
尽管此前已有许多关于皮肤树突状细胞迁移的研究，但对于接种卡介苗（Bacille Calmette-Guérin, BCG）后皮肤树突状细胞向引流淋巴结（DLN）动员的情况，相关信息仍然匮乏，卡介苗是一种减毒活疫苗株 Mycobacterium bovis 用于预防接种 M. tuberculosis卡介苗（BCG）接种于皮肤，引起局限性感染，从而触发辅助性T细胞1型（Th1）免疫应答。目前对从BCG感染的皮肤迁移至引流淋巴结（DLN）的树突状细胞（DC）亚群及其迁移过程中调控因子的认识仍不充分。针对上述问题，本研究建立了一种简单而新颖的方法，即注射荧光染料5-和6-羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE） 原位 追踪树突状细胞迁移至引流淋巴结 3. 将BCG接种于C57BL/6小鼠后足垫，牺牲前一日在同一足垫注射高浓度CFSE。24小时后处死动物，取出引流侧腘窝淋巴结（pLN）并制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。该实验可鉴定从足垫皮肤迁移至引流淋巴结（DLN）的细胞图1).
此外，基因靶向小鼠可用于帮助鉴定细胞迁移至深部淋巴结（DLN）所必需的因素。利用该检测方法，本研究报告的作者此前发现 EpCAM低 CD11b高 迁移性皮肤树突状细胞通过白细胞介素-1受体及胞内接头分子MyD88调控的过程将卡介苗转运至引流淋巴结 3基于上述Bollampalli报告的CFSE迁移实验方案 等3 本文描述了利用流式细胞术检测和分析迁移性皮肤树突状细胞的方法，并讨论了该实验方法的优缺点。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>5-和6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯&lt;br/&gt;（CFSE）</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>卡介苗（Bacille Calmette-Gu&amp;eacute;rin，BCG）</td><td></td><td></td><td>巴斯德株，本实验室制备</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td>本实验室制备</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>本实验室制备</td></tr><tr><td>过滤水</td><td></td><td></td><td>本实验室制备</td></tr><tr><td>BD Plastipak 3 ml 注射器</td><td>BD 医疗外科系统</td><td>309658</td><td>替代品：5 ml 注射器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>TPP</td><td>91015</td><td>聚丙烯</td></tr><tr><td>5 ml 圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>3272948</td><td>聚苯乙烯</td></tr><tr><td>Univentor 400 麻醉机</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr><tr><td>Monojet 3/10 ml 注射器</td><td>Medicarrier</td><td>8881511144</td><td>29 G × 1/2 英寸</td></tr><tr><td>无菌滤器</td><td>TPP</td><td>99500</td><td>PES 膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EPPI-Pistill 匀浆器</td><td>Schuett biotech</td><td>3.200 512</td><td>聚丙烯</td></tr><tr><td>Allegra X-30R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>B01145</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker 计数板</td><td>VWR</td><td>631-0920</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 螺口微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72.730</td><td>聚丙烯</td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf 微量离心管</td><td>VWR</td><td>700-5239</td><td>聚丙烯</td></tr><tr><td>70 微米细胞筛</td><td>VWR</td><td>734-0003</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR-II 流式细胞仪，使用 FACSDiva 软件操作</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>已停产。可使用其他流式细胞仪，需至少能检测 6 种荧光染料</td></tr><tr><td>FlowJo 细胞分析软件</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;克隆号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II I-A/I-E&amp;nbsp;</td><td>M5/114.15.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>M1/70</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>HL3</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32（Fc阻断剂）</td><td>2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD326/EpCAM</td><td>G8.8</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>2E7</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD80</td><td>16-10A1</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD86</td><td>GL-1</td><td>Biolegend</td><td></td></tr></tbody></table>

基于cfse的检测方法用于研究小鼠皮肤树突状细胞在感染牛分枝杆菌卡介苗（mycobacterium bovis bacille calmette-guérin）期间向引流淋巴结的迁移

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

树突状细胞（DCs）在启动免疫应答中具有重要作用，部分原因是它们能够摄取抗原并将其转运至引流淋巴结（DLN）。在感染过程中，DCs向引流淋巴结的迁移过程十分复杂，目前尚未完全阐明。本文介绍了一种创新且简便的检测方法，该方法利用荧光染料5-和6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）来追踪C57BL/6小鼠足垫感染Mycobacterium bovis卡介苗（BCG）期间DCs的迁移过程。该检测方法可用于表征在BCG刺激下主动迁移至引流性腘窝淋巴结的皮肤DC亚群。本实验方案源自一项BCG模型研究，其中通过流式细胞术鉴定了迁移性皮肤DCs。该方法适用于研究和鉴定在足垫接种微生物、其代谢产物或其他炎性刺激物后归巢至腘窝淋巴结的DCs或其他细胞，进而可用于研究调控这些细胞迁移的相关因素。

基于CFSE的迁移实验（图1）结合流式细胞术，用于检测和表征在足垫接种BCG后出现在足部引流淋巴结（pLN）中的CFSE标记细胞。pLN中大部分CFSE信号出现在MHC-IIhigh和CD11c+/low细胞上（图2A），这与从皮肤迁移至皮肤引流淋巴结（DLN）的树突状细胞（DCs）特征一致11。与PBS注射对照组小鼠相比，BCG感染小鼠的pLN中CFSE标记的MHC-IIhigh CD11c+/low细胞的频率和总数均增加（图2B-C），提示BCG增强了这些细胞向引流淋巴结的迁移。由于该实验检测的是24小时内的迁移情况，因此可以确定在感染后第5天，皮肤DC仍持续进入引流淋巴结（图2C）。这表明在本模型中，DC的迁移时间远超过pLN中抗原特异性CD4+ T细胞初始活化的时限3。此外，迁移的皮肤DC表达较高水平的共刺激分子CD80和CD86（图2D）。这一结果与既往皮肤组织块培养和FITC皮肤标记实验的观察结果一致11，支持迁移性DC为活化状态细胞的观点。重要的是，淋巴结驻留型DC（MHC-II+ CD11chigh细胞）和浆细胞样DC（MHC-IIlow CD11clow PDCA-1+细胞）——这两类细胞通过高内皮微静脉而非传入淋巴管进入炎症淋巴结12——均未检测到CFSE标记（图2E-F），进一步说明CFSE标记主要发生在足垫部位。
由于MHC-IIhigh CD11c+/low 细胞并非单一的树突状细胞亚群，而是包含多个不同的亚群13，因此在用于流式细胞术检测的抗体染色组合中（材料表），额外加入了表面标志物CD103、EpCAM（CD326）和CD11b，以进一步表征迁移性树突状细胞群体（图3）。通过该方法，鉴定出EpCAMlow CD11bhigh 细胞亚群是响应卡介苗（BCG）感染的主要迁移性皮肤树突状细胞亚群（图3）。
此处所示的流式细胞术数据是在一台配备四种激光器（488、532、640 和 405 nm）的流式细胞仪上获取的。数据使用细胞分析软件进行分析。除材料表中指定的仪器外，其他多色流式细胞仪也可用于成功检测上述研究中提及的标志物，或其他细胞类型上的其他标志物。对于本文所述的实验方案，需要使用能够检测六种不同荧光染料的细胞仪。重要的是，每种抗体所使用的克隆均已注明（材料表）。需根据所用流式细胞仪的激光器和检测通道情况，合理选择荧光染料偶联物。同样，抗体需要进行滴定，以确定染色时最适的稀释比例。
BCG注射组与PBS注射组样本中各细胞亚群的群体频率通过图表表示，并结合总细胞数用于计算所定义门控DC亚群的绝对数量。数据组均值间差异的显著性采用Student's t检验或适用的单因素方差分析（ANOVA）进行分析，显著性阈值设为p &lt; 0.05。异常值经Grubbs's异常值检验后从分析中剔除。
<img alt="C57BL/6 小鼠实验示意图；BCG，CFSE 注射；流式细胞术；免疫学研究。" src="/files/ftp_upload/54620/54620fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 实验流程概览：BCG 足垫感染模型与基于 CFSE 的细胞迁移检测。 将 BCG 接种至 C57BL/6 小鼠的后足垫。在感染后的不同时间点，以及处死前 24 小时，将荧光染料 CFSE 注射至先前接种 BCG 的同一足垫。随后分离引流的腘窝淋巴结，并通过流式细胞术对 CFSE 标记的细胞进行表征分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54620/54620fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；MHC-II、CD11c、CFSE 数据；BCG 作用；CD80/CD86 表达图示。" src="/files/ftp_upload/54620/54620fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 迁移性皮肤树突状细胞是 BCG 足垫感染后迁移至引流淋巴结的主要细胞群体。 将 1 × 106 CFU 的 BCG 注射至 C57BL/6 小鼠足垫以建立感染模型。在处死动物前 24 小时，向同一足垫注射 0.5 mM 的 CFSE。随后收获腘窝淋巴结（pLN），制备成单细胞悬液并进行流式细胞术分析。在 BCG 感染后第 1 天进行的测量中，CFSE 于 BCG 注射后 2 小时给予。(A 和 B) 斑马图显示，在 BCG 感染后第 3 天，引流 pLN 中的 MHCIIhigh 和 CD11c+/low 细胞为主要的 CFSE 阳性细胞群体。(C) 将 BCG 注射组与 PBS 注射组小鼠在不同时间点的 pLN 中 CFSE 标记的 MHCIIhigh CD11c+/low 细胞的频率及总数量绘制成图。(D) 在 BCG 感染后第 3 天，测定 pLN 中 CFSE+ 与 CFSEneg 的 MHC-IIhigh CD11c+/low 皮肤树突状细胞上 CD80 和 CD86 的平均荧光强度（MFI）。(E) 通过流式细胞术检测 BCG 感染后第 3 天皮肤树突状细胞（MHC-IIhigh CD11c+/low）、淋巴结驻留型树突状细胞（MHC-II+ CD11chigh）以及 (F) 浆细胞样树突状细胞（MHC-IIlow CD11clow PDCA-1+）中 CFSE 的表达情况。每次实验中，BCG 感染组至少使用 5 只小鼠，PBS 注射对照组使用 3 只小鼠。图中误差棒表示均值的标准误。各亚群中 CFSE 标记细胞的总数见 Bollampalli et al., PLoS Pathog 2015, 11:e1005206 3。* 表示 BCG 感染组与 PBS 对照组之间的统计学显著差异。图示为两次独立实验中的一次结果。本图经出版方许可改编自 Bollampalli et al., PLoS Pathog. 2015, 11:e1005206 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54620/54620fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="树突状细胞的流式细胞术图解；CD103、CD11b、EpCAM 标记物；BCG 免疫应答图。" src="/files/ftp_upload/54620/54620fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. EpCAMlow CD11bhigh DC 是 BCG 足垫感染后迁移至引流淋巴结的主要皮肤 DC 亚群。 C57BL/6 小鼠按 图 2 所示方法注射 BCG 和 CFSE。（A）Zebra 图显示所采用的设门策略（上图）以及 BCG 感染后不同时间点各定义亚群中 CFSE+ 细胞的频率（下图）。各亚群内的频率可能随感染后时间点不同而变化。BCG 感染后 3 天，所有淋巴结细胞中约有 0.2% 的 MHC-IIhigh CD11c+/low 细胞。其中约 6% 为 CD103+ 细胞。在 MHC-IIhigh CD103阴性 门内所发现的亚群中，约 42% 为 CD11bhigh EpCAMlow 细胞，27% 为 CD11blow EpCAMlow 细胞，7% 为朗格汉斯细胞（LCs）。（B）显示 BCG 感染后不同时间点各定义亚群中 CFSE+ 细胞的总数量。每项实验中，BCG 感染组至少使用 5 只小鼠，PBS 对照组使用 3 只。柱状图表示平均值的标准误。* 表示与 PBS 注射对照组相比具有统计学显著差异。本图为三次独立实验之一。图经出版方许可转载自 Bollampalli et al., PLoS Pathog 2015, 11:e1005206 3。（<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54620/54620fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

本文描述了一种在小鼠中追踪细胞从皮肤迁移至引流淋巴结的检测方法，该方法可用于表征在足垫感染卡介苗（Bacille Calmette-Guérin）后迁移至淋巴结的皮肤树突状细胞。

基于CFSE的检测方法用于研究小鼠皮肤树突状细胞在感染牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin）期间向引流淋巴结的迁移

树突状细胞（DCs）在启动免疫反应中具有重要作用，部分原因是其能够摄取抗原并将其转运至引流淋巴结……

本荧光细胞示踪剂检测方法的总体目标是，在小鼠足垫感染卡介苗（Bacille Calmette-Guerin，BCG）后，监测并表征从皮肤迁移至引流淋巴结的特定目标细胞群体。我们已利用该技术鉴定出在皮肤BCG感染后归巢至引流淋巴结的树突状细胞群体。该技术通过在明确的24小时时间窗口内注射标记物，实现了对细胞迁移过程的研究。该方法的可视化演示至关重要，因为足垫注射和淋巴结分离步骤仅通过文字难以掌握。对于微小杆菌 Bovus BCG 的注射，在通过脚趾夹捏确认小鼠达到适当镇静水平后，使用装有29号1/2英寸针头的注射器，将30 µL PBS 中含1×10⁶个菌落形成单位的细菌接种至8至12周龄小鼠的后足垫。对照组足垫仅注射 PBS。然后观察动物，直至其完全恢复卧姿并能够将重量施加于注射过的足垫。对于CFSE注射，在BCG注射后的适当时间点，将一管室温下5毫摩尔的CFSE用PBS稀释十倍，注意充分重悬溶液。随后，用稀释后的CFSE溶液填充注射器，并向之前接受首次注射的同一后足足垫内注射20微升。CFSE注射后24小时，仔细在后侧大腿做一纵向切口，清除肌肉周围的脂肪组织。接着，使用剪刀和镊子暴露并切除位于膝窝脂肪囊深处的腘窝淋巴结。将淋巴结转移至盛有0.5毫升冰上预冷的无菌PBS的容器中，并将淋巴结置于含5毫升PBS的六孔板的一孔内，用3毫升注射器的末端通过70微米细胞滤筛研磨匀浆。用另外5毫升缓冲液冲洗滤器，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。随后离心细胞，并用适量缓冲液重悬沉淀。为进行流式细胞术标记，将1×10⁶至10×10⁶个细胞分装至5毫升圆底聚苯乙烯管中，用新鲜FACS缓冲液洗涤细胞。将沉淀物重悬于 50 至 100 微升含有抗小鼠 CD16/CD32 抗体的适当抗体混合液中，以阻断在冰上、避光条件下 FACS 缓冲液中的非特异性 FC 介导相互作用。孵育 30 至 45 分钟后，用 FACS 缓冲液洗涤细胞，并将沉淀物重悬于 50 至 100 微升新鲜 FACS 缓冲液中。在腘窝淋巴结中，大部分 CFSE 标记信号出现在 MHC-II 高表达且 CD11c 低表达的细胞中，这与迁移至皮肤引流淋巴结的皮肤树突状细胞特征一致。与PBS注射对照组小鼠相比，BCG感染小鼠的腘淋巴结中这些标记细胞的频率和总数均增加，提示BCG可增强这些细胞向引流淋巴结的迁移。皮肤树突状细胞在感染后持续进入引流淋巴结，时间长达五天，这使得在本模型中树突状细胞的迁移过程明显超过了腘淋巴结内抗原特异性CD4阳性T细胞初始活化的时限。此外，迁移的皮肤树突状细胞表达较高水平的共刺激分子，支持这些迁移的树突状细胞已被活化的观点。重要的是，通过高内皮微静脉而非传入淋巴管进入炎症淋巴结的单核样和浆母样树突状细胞均对CFSE呈阴性，进一步证实CFSE标记主要发生在足垫部位。此外，进一步的流式细胞术分析显示，在BCG感染后，EpCAM低表达、CD11b高表达细胞亚群是迁移至腘窝淋巴结的主要皮肤树突状细胞亚群。一旦掌握，该技术若操作得当，可在五分钟内完成。在进行该操作时，需谨慎处理注射部位和注射体积；解剖过程中应格外注意，避免损伤引流淋巴结。操作完成后，可进一步采用流式细胞术或共聚焦显微镜等方法，对特定细胞亚群的微表达进行分析。该技术为研究人员提供了在感染或疫苗接种后24小时内，追踪细胞从皮肤迁移至引流淋巴结的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握足垫注射的操作方法，并学会定位和分离引流淋巴结，以追踪和表征感兴趣的迁移性树突状细胞群体。

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