Name: リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶジスルフィド架橋ミセルの簡便合成法。過酸化水素酸化により薬物を封入したナノ粒子を大量生産し、還元環境で解離する特性を利用したがん治療への標的薬物送達システムの開発に応用可能です。

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著者は編集の助けに対してMs.Alisha Knudsonに感謝します。また、NIH/NCI(3R01CA115483、K.S.L.)、DoD PRMRP Award(W81XWH-13-1-0490、K.S.L.)、NIH/NCI(1R01CA199668、Y.L.へ)、NIH/NICHD(1R01HD086195、Y.L.へ)からの財政支援に感謝の意を表したいと思います。

倫理の声明：メス無胸腺ヌードマウス（ニュー/ニュー株）、6〜8週齢は、購入した後、AAALACガイドラインに従って病原体を含まない条件下で飼育し、任意の実験の前に、少なくとも4日間順化させたれました。全ての動物実験は、機関のガイドラインに準拠して行われ、プロトコル番号07から13119と第09から15584によると、カリフォルニア大学デービス校での動物の使用およびケア管理諮問委員会によって承認されました。 TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8の1の合成<ol><li>丸底フラスコに、無水ジメチルホルムアミド（DMF）、氷上で寒さの10〜20 ml中のMeO-PEG 5K -NH 2（2グラム、0.4ミリモル）を溶解。 </li><li>ガラスビーカー中で、3当量を溶解します。 1-ヒドロキシ-6-クロロ - ベンゾトリアゾール（HOBt）とのエステル、3当量の。 N、N N&#39;-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、および3当量の。無水D中のカルボニル（Fmoc）2のLys-OHMF（10-15 ml）を。磁気撹拌プレート上で15〜20分間攪拌します。 </li><li>氷浴を外し、室温で一晩反応混合物を攪拌のMeO-PEG 5K -NH 2を含む反応フラスコに混合物を追加します。 </li><li>薄層クロマトグラフィー（TLC）16とカイザーテスト17（黄色が遊離NH 2が存在しないことを示している）との反応の完了を確認します。反応フラスコを氷冷エーテル約200 mlで添加することによって、（2のMeO-PEG 5K -Lys（NH-Fmocの）1）ポリマー生成物を沈殿させます。遠心分離（6,000×gで、4℃で6分）を経由して沈殿したポリマーを分離します。 <ol><li> TLCを行うために、シリカゲルでコーティングされたTLCプレート上のサンプルを見つけます。ジクロロメタン/メタノールを使用し（9：1）を移動相として。 TLCプレートを展開した後、UVランプの下でスポットを観察します。 1つはまた、ホットプレート上のアミンスポットを可視化するために染色試薬をニンヒドリン使用することができます。 </li><li>カイのためにSERのテスト、カイザーの試薬を含有するガラス管にサンプルを少し置きます。 5分間、100℃でこれを加熱して（溶液の色が黄色のままであれば、反応が完了した）色の変化を見ます。 </li></ol></li><li>再溶解する（ステップ1.4を参照）の無水DMF中の製品（10〜20 ml）を、沈殿、遠心分離を繰り返します。 </li><li>その後、繰り返しステップ1.5、および氷冷エーテルでポリマー沈殿物を3回洗浄します。 </li><li>クリーンな反応フラスコにポリマー沈殿物1を移し、残留エーテルを除去するために、高真空源にフラスコを接続します。 </li><li> 1中間体をポリマーにDMF中の20％の約20〜30ミリリットル（v / v）の4メチルピペリジンを準備して追加します。完全に溶解するまで撹拌します。 3時間の反応を実行します。 </li><li> completioを確認するためにTLC 16とカイザーのテストを（青色が遊離NH 2の存在を確認）17（ステップ1.4を参照）を実行反応のn個。反応が完了した場合、（1.4〜1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進みます。 </li><li>真空下でポリマー生成物2（のMeO-PEG 5K -Lys（NH 2）2）を乾燥させます。 </li><li> （1.1から1.7ステップ）製品3を生成する中間体2の上にカルボニル（Fmoc）2のLys-OH結合の1以上のラウンドを行う（のMeO-PEG 5K -Lys（リジン（NH-のFmoc）2）2）。脱保護（1.8から1.10ステップ）のFmoc基（4、のMeO-PEG 5K -Lys（リス（NH 2）2）2）と夫婦（1.1から1.7ステップ）カルボニル（Fmoc）のLys（BOC）-OHへ第三世代の樹枝状ポリリジン生成（5、のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 - （カルボニル（Fmoc）のLys（BOC））4）PEG鎖の一方の端部にある4つのBocおよびFmoc基で終端。 </li><li>反応フラスコに得られたポリマー中間体5を転送します。以下のように、ジクロロメタン（DCM）中の1（v / v）のトリフルオロ酢酸（TFA）：eparate反応フラスコに、1を準備します。ポリマー5の中間に1 TFA / DCM（v / v）の混合物：1 15-20 mlを加え。ポリマーが完全に溶解するまで混合物を撹拌しました。さらに3時間撹拌。 </li><li>反応の完了を確認するために（青色が遊離NH 2の存在を確認）17（ステップ1.4を参照）TLC 16とカイザーのテストを実行します。反応が完了した場合、粘性溶液が得られるまで、空気とポリマー型TFA / DCM混合物を蒸発させます。 （1.4から1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進んでください。真空下で- （（（のFmoc）のLys（NH 2））4 -Lys-Lysの2のMeO-PEG 5K）ポリマー生成物6を乾燥させます。 </li><li>反応フラスコに6中間転写ポリマー。 8当量を含む無水DMFの約40ミリリットルを使用してください。 Nの、N個の -diisopropylethylamiNE（DIEA）は、ポリマー中間体6を溶解しました。ガラスビーカー中で、12当量を溶解します。 HOBt、12当量。 DIC、および12当量の。無水DMF 20〜25ミリリットル中にカルボニル（Fmoc）のCys（Trtの）-OHの。 10〜15分間振盪し、次いで6を含む反応フラスコに反応混合物に加えます。一晩反応を実行します。 </li><li> TLC 16とカイザーのテストとの反応の完了を確認し（ステップ1.4を参照してください。黄色は遊離NH 2が存在しないことを示している）17。 （カルボニル（Fmoc）のLys - - （カルボニル（Fmoc）のCys反応が完了した場合、（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2生成物7を単離するために、生成物1（ステップ1.4〜1.6）で述べたように、エーテル沈殿に進み（Trtの）））4。 </li><li>ステップ1.8で概説したように、7上のFmoc脱保護を行い、生成物8を得るために、（PEG 5K -Lys-Lysの2 - （Lysの（NH 2） - （Cysを（NH 2）（Trtの）））4）。カップルカルボニル（Fmoc）-PEG 2 -Suc-OH（「EBES「リンカー、24当量）ポリマー中間体上の中間9（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4得るためのHOBt / DIC媒介カップリングのために上に概説した手順を使用して- （システイン（Trtのを） ）4（EBES（NH-のFmoc））8）。 </li><li> Fmocの脱保護の1以上のラウンドを実行します（1.6から1.8ステップ）中間体10を取得する（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4 - （システイン（Trtの））4（EBES（NH 2））8）。 </li><li>反応フラスコにポリマー中間体10を転送し、それを溶解させ、無水DMF（30〜40 ml）を追加します。別の反応フラスコに、24当量を溶解します。無水DMF中の（以前に公開された手順に従って調製）CAOSu（20〜ml）を18。 48当量を追加します。 N、N-ジイソプロピルエチルアミンの、それは10〜15分間攪拌しましょう。 10を含有する反応フラスコに内容物を移し、反応はO実行してみましょうvernight。 </li><li> TLC 16とカイザーのテストとの反応の完了を確認し（ステップ1.4を参照してください。黄色は遊離NH 2が存在しないことを示している）17。 （のCys（Trtの））4 -Ebes -反応が完了した場合、製品11（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4を分離するために（1.4から1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進みます8 -CA 8）。脱イオン水の中に透析し、白色粉末を得た試料を凍結乾燥。 </li><li>反応フラスコに中間体ポリマー11を配置します 。準備し、ポリマー溶液にTFA / 1,2-エタンジチオール（EDT）/トリエチルシラン（TIS）の20ミリリットル/ H 2 O（94 / 2.5 / 1 / 2.5、v / v）の混合物を追加します。完全に溶解するまで混合物を攪拌します。 4時間の反応を実行します。 TLC 16により反応の完了を確認してください。 </li><li>ヒュームフードの下では、ポリマー-TFA / EDT / TIS / H 2に空気を吹き込みますOの混合溶液が粘性になるまで。最終製品、12（PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8）を単離するために、（1.4〜1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進んでください。アセトニトリル中に溶解し、白色粉末を得、それを凍結乾燥。 </li></ol> PTX装填ミセルの調製<ol><li>標準的な蒸着法を用いて、PTX-ロードPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8ミセルを準備します。 <ol><li>クロロホルムの1ミリリットル（のCHCl 3）でPTXの異なる量（1-9 mg）を用いてTD 20mgを溶解させます。均質、乾燥ポリマーフィルムを得るために、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。薬物負荷ミセルの形成を可能にするために、必要に応じて、40 kHzで30分間超音波処理に続いて、ボルテックスによってリン酸緩衝食塩水（PBS）1mlでフィルムを再構成します。 </li><li> 3％の6μlの（w / w）のH 2 O 2（1当量を追加します。FRにTD上のチオール基を酸化する）チオール基をEE。エルマン試験19で示すように、遊離チオール基のレベルは、一定の低い値のままで一度、さらなる特徴付けのためのミセル溶液を使用してください。 </li><li>サンプルを滅菌するために0.22μmのフィルターでソリューションをフィルタリングします。 9回のアセトニトリルを添加し、超音波処理の10分を実行することによって、ミセルからの薬物を解放した後、HPLC 20システムにミセルに装填された薬物の量を分析します。移動相としてアセトニトリル/水を用いてHPLC用C18カラムを使用してください。 </li><li> HPLC面積値と11の標準的な薬剤の濃度の間の検量線による薬物負荷を計算します。 注：充填効率が初期薬物含量のミセルに装填薬の比として定義されます。 </li></ol></li></ol>ミセルの3キャラクタリゼーション<ol><li>メートルのサイズとサイズ分布を測定動的光散乱（DLS）測定器29でicelles。室温で測定を行い、1mg / mlのでミセル濃度を保ちます。 注：粒度分析を行うブランクとしてPBSを使用し、実際のサンプルについて粒子サイズを記録します。サンプルのための三連で測定値を取り、その後、測定値を平均します。 </li><li>以前に13,21説明したように、疎水性蛍光プローブとしてピレンとの架橋の前と後のPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8の臨界ミセル濃度（CMC）を測定する蛍光スペクトルを使用してください。 注：一般的に、ミセル濃度は、5×10 -7〜5×10 -4 Mの範囲であります</li></ol> 4. SDS中のミセルの安定性を持つか、エージェントを低下させることなく、 <ol><li> PBS中のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液（7.5 mg / mlで）およびジスルフィド架橋ミセル（1.5 mg / mlで）のストック溶液を調製します。次に、U最終SDS濃度がである、混合溶液を作り、原液を歌う2.5ミリリットルミリグラム/及びミセル濃度が1.0 mg / mlでです。 </li><li> 10mMのグルタチオン（GSH）の存在の有無にかかわらず、所定の時間間隔でミセル溶液の（段階3.1で述べたように）サイズおよびサイズ分布を測定します。 </li></ol> 5.溶血アッセイ<ol><li> PTX-ロードされ、非架橋ミセル（PTX-NCMS）の溶血可能性を評価する以前に公開された手順11に従って製造から収集ヌードマウスから新鮮なクエン酸処理血液を用いて、PTX-ロード架橋されたミセル（PTX-のDCM）テールベール。 <ol><li> 2％の最終濃度まで、10分間1000×gで血液試料（1.0 ml）を、遠心分離によって赤血球を収集するPBSでそれらを3回洗浄し、次いでPBSで再懸濁細胞ペレット。 </li></ol></li><li>異なる濃度（0.2および1.0で赤血球懸濁液200μlを混ぜますそれぞれPTX-NCMSとPTX-のDCMのmg / mlで）、およびインキュベーターシェーカー中で37℃で4時間インキュベートします。 </li><li> 5分間、3000×gでミセル - 赤血球混合物を遠心します。 96ウェルプレートに、すべてのサンプルの上清100μlを移します。マイクロプレートリーダーを用いて540nmで上清中の遊離ヘモグロビンの吸光度を測定します。 注：トリトン-100（2％）とPBSとインキュベートしたRBCを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用されます。 - /（OD ポジティブコントロール - OD ネガティブコントロール ）×100％RBC溶血=（OD ネガティブコントロール OD サンプル ）：RBCの溶血パーセントは以下の式で計算されます。 </li></ol>

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Y. Li と K.S.L. は、可逆架橋ミセル系に関する出願中の特許 (米国特許出願 61/485,774) の発明者です。K.S.L.は、原稿に記載されているナナタピューティクスの開発を計画しているLamnoTherapeutics Inc.の創設科学者です。残りの著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

いくつかのナノ粒子は、薬物送達におけるそれらの潜在的使用のために検討されています。リポソームドキソルビシンおよびパクリタキセル（PTX）は、ヒト血清アルブミンナノ凝集物は、癌治療のためにFDAによって承認さnanotherapeutics間にある-loaded。臨床的に有効なものの、これらnanotherapeuticsの両方のサイズが比較的「大」であり、それらは肝臓および肺に蓄積する傾向があります。比較的小さい粒子サイズおよびより高い薬物負荷能力を持つ高分子ミセルは、薬物送達のためのナノキャリアを浮上しています。独自のコア - シェル構造は、「物理的なカプセル化によって水性条件下で「疎水性薬物分子を「可溶化」。高分子ミセルは、薬物を封入で長い貯蔵寿命、高効率で私たちの研究室の形単分散ナノ粒子（10-50 nmの粒子サイズ）で製造した、明確に定義されたのTDで構成される。堅牢なTDプラットフォームの多くの利点の一つは、ポリマーの多様性です。多数の薬物、蛍光色素、および標的リガンドを容易TDプラットフォーム13,15,24に組み込むことができます。 <stro...

ナノテクノロジーは、生物医学分野1の数を恩恵を受けている高速新興分野です。ナノ粒子は、従来の治療法の他の種類と実現不可能な特性を設計およびチューニングのための機会を提供しています。ナノキャリアは、生分解に対する薬物の安定性を向上させる、薬物の循環時間を延長、薬物の溶解度の問題を克服し、および標的薬物送達のために、1,2-同時送達造影剤のために微調整することができます。ナノ粒子ベースの送達システムは、癌の画像化および治療に有望です。腫瘍血管系は、巨大分子への漏出性であり、強化された透過性および保持（EPR）効果3を介して腫瘍部位でのナノ粒子の循環の優先的な蓄積につながることができます。積極的に抗がん剤の担体として追求されているいくつかのナノキャリア（ 例えば、リポソーム、ヒドロゲル、および高分子ミセル）の中でも、高分子ミセルは、番目の上に広い人気を得ています電子十年間4,5。 高分子ミセルは、静脈内投与には、潜在的にユニマーにそれらの解離をもたらす、臨界ミセル濃度（CMC）以下に希釈することができる、熱力学的システムです。架橋戦略はユニマーにミセル解離を最小化するために使用されてきました。しかし、過度に安定化されたミセルは、それによって全体的な治療効果を低下させる、標的部位での放出の薬物を防止することができます。いくつかの化学的アプローチが作るために検討されている架橋酸化還元に応答して、または、そのような還元可能なジスルフィド結合6,7およびpH-切断可能な8または加水分解可能なエステル結合の9,10などの外部刺激に分解可能。 我々は以前11-15 telodendrimers（TD）と呼ばれる樹状コール酸（CA）ブロック、直鎖ポリエチレングリコール（PEG）コポリマーからなるミセル、ナノ粒子の設計および合成が報告されています</SUP&gt;。これらのTDは、PEG NK -CAyとして表現されている（キロダルトンではn =分子量（K）、yはコール酸（CA）単位の数を=）。それらは、疎水性コア中のパクリタキセル（PTX）およびドキソルビシン（DOX）などのカプセル化薬剤におけるそれらの小さなサイズ、長い貯蔵寿命、及び高い効率によって特徴付けられます。例えばPEG、リジン、およびCAなどTDのビルディングブロックは、生体適合性であり、そしてPEGコロナの存在は、細網内皮系によってミセル化ナノ粒子の非特異的な取り込みを防止する、「ステルス」ナノ粒子特性を付与することができます。 チオール化線形樹枝状ポリマーは、簡単に私たちの標準のTDの樹状オリゴリジン骨格にシステインを導入することによって生成することができます。この記事では、のTDの疎水性コア（ 図1）にジスルフィド架橋を導入することによって、可逆的に架橋されたミセル薬物送達システムを製造するための容易なプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>MeO-PEG5K-NH2</td><td>Rapp Polymere</td><td>125000-2</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td><td>Aaptec</td><td>AFK107</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Anaspec</td><td>AS-20132</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Aapptec</td><td>AAC105</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>エチルエーテル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>E134-20</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジイソプロピルエチルアミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T6508</td><td>腐食性、取り扱いには注意が必要</td></tr><tr><td>4-メチルピペリジン</td><td>アルファ-エーザー</td><td>L-02709</td><td></td></tr><tr><td>エベスリンカー</td><td>アナスペック</td><td>AS-61924</td><td></td></tr><tr><td>コール酸</td><td>シグマAldrich</td><td>C1129</td><td></td></tr><tr><td>1,2-エタンジオール</td><td>シグマAldrich</td><td>02390</td><td>ヒュームフード内のハンドル。使用後は手袋を漂白してください。</td></tr><tr><td>トリイソプロピルシラン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム (無水)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素溶液 30%</td><td>Aaron Industries</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HoBt-Cl</td><td>Aaptec</td><td>CXZ096</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>雌性胸部ヌードマウス (Nu/Nu 株), 6&ndash;8週齢</td><td>のハーラン(カリフォルニア州リバモア)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

ナノメディシンは、生物医学アプリケーションのスケールでナノメートルの粒子の独特の特性を活かした治療の新たな形です。治療結果を最大にするために、薬剤に関連する副作用を軽減するための薬物送達を向上させる現代のナノ医療の基礎の一部です。特に、ナノ粒子は、癌治療に広く応用されています。デザイン、アプリケーション、および腫瘍の微小環境に基づいて、生産の高度な柔軟性を提供するナノ粒子は、臨床診療への迅速な翻訳をより効果的であることが予測されています。高分子ミセル、ナノキャリアは、薬物送達用途のために人気があります。 この記事では、我々は明確に定義された両親媒性の線状の樹状共重合体（telodendrimer、TD）の自己組織化に基づく薬物負荷、ジスルフィド架橋されたミセルを合成するためのシンプルで効果的なプロトコルを記述します。 TDは、ポリエチレンGLから構成されています親水性セグメントおよび溶液ベースのペプチド化学を用いて、アミン末端PEGに段階的に取り付けられたコア用疎水性部分としてチオール化コール酸クラスタとしてycol（PEG）。例えば、パクリタキセル（PTX）のような化学療法剤は、標準的な溶媒蒸発法を使用してロードすることができます。 O 2媒介性酸化は、以前のTD上の遊離チオール基からイントラミセルジスルフィド架橋を形成するために利用されました。しかし、反応が遅く、大量生産のために実行可能ではなかったです。最近、H 2 O 2媒介酸化法は、より実現可能かつ効率的な方法として調査し、それが以前に報告された方法よりも96倍高速でした。このアプローチを用いて、PTX装填、ジスルフィド架橋されたナノ粒子50gを正常に狭い粒度分布および高い薬物負荷効率で製造されています。得られたミセル溶液の安定性は、共培養Wなどの破壊条件を用いて分析します還元剤を伴うまたは伴わない洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム、第i。その非架橋対応物と比較した場合、薬物負荷、ジスルフィド架橋されたミセルは、以下の溶血活性を示しました。

薬物ロードされ、ジスルフィド架橋ミセルの調製とキャラクタリゼーション 両親媒性ポリマーPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8は、癌薬物送達のためのジスルフィド架橋ミセル系を形成することができる樹枝状ポリマーです。構造的には、分枝状ポリ（リジン - システインEBES）バックボーンを介して線状PEG分子（親水性ドメイン、分子量5K）の一端に連結されたコール酸（疎水性ドメイン）の樹枝状オリゴマーとして定義されます。他の報告されたミセル系のこれらのブロックコポリマーを使用することのいくつかの利点があります。まず、それは容易に段階的な溶液相縮合反応を介して合成することができます。第二に、十分に確立された液相の段階的なFmocペプチド化学によって調製いくつかの他の報告された両親媒性ポリマー、チオール化ポリマー系と比較して、明確に定義されたstructuを有します再。これは、凍結乾燥粉末の形...

高い特異性で副作用を軽減して腫瘍部位に抗がん剤を送達するためには、ナノ粒子に基づく新しい方法が必要です。ここでは、過酸化水素を介した酸化によって容易に調製でき、還元腫瘍環境下で効率的に解離してペイロードを放出できるジスルフィド架橋ミセルについて説明します。

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

この手順の全体的な目標は、標的薬物送達のために薬物をロードしたジスルフィド架橋ミセルを合成するためのシンプルで効果的なプロトコルを提供することです。この方法は、ナノメディシン分野の質問に答えるのに役立ちます。例えば、安定したナノ製剤を効果的に製造する方法など。この技術の主な利点は、ジスルフィド架橋ミセルを大規模に容易に合成できることであり、これは患者の臨床研究に非常に望ましいものです。この手順を開始するには、丸底フラスコに2グラムのモノメチル末端ポリエチレングリコールモノアミンを追加します。.無水DMFを10ミリリットル加えて溶解します。氷の上で冷やします。ヒドロキシベンゾトリアゾール3等量、DIC3等量、およびジ-eth-moc保護リジン3等量を丸底フラスコに加えます。次に、10ミリリットルの無水DMFを追加します。混合物を磁気攪拌板で20分間攪拌します。次に、モノメチル末端ポリエチレングリコールを含む丸底フラスコに混合物を追加します。丸い底のフラスコを氷浴から取り出し、室温で一晩かき混ぜます。攪拌が完了したら、テキストプロトコルに詳述されているように、反応の完了を確認します。反応フラスコに200ミリリットルの氷冷エーテルを加えます。6, 000 x gで摂氏4度で6分間遠心分離し、沈殿したポリマーを分離します。沈殿と遠心分離のプロセスを2回繰り返し、沈殿する前に毎回製品を10ミリリットルのDMFに再溶解します。次に、ポリマーを氷冷エーテルで3回洗浄します。チューブを高真空源に接続して、残留エーテルを除去します。この後、DMF中の20ミリリットルの20%4-メチルピペリジンをポリマーに加えます。溶解が完了するまで攪拌します。3時間、反応を楽しませてください。反応の完了を確認したら、高分子生成物を乾燥させます。次に、真空下でポリマー中間体番号2を行い、テキストプロトコルに概説されているように追加のポリマー合成ステップを実行します。ポリマー中間体10番が生成されたら、それを反応フラスコに移します。無水DMFを30ミリリットル加えます。新しいフラスコに24相当の活性コール酸を20ミリリットルのDMFに溶解します。次に、48当量のN、N-ジイソプロピルエチルアミンを追加します。10分間かき混ぜます。攪拌が完了した後、混合物をポリマー中間体番号10を含む反応フラスコに移します。反応が一晩中実行されるのを待ちます。翌日、反応の完了を確認し、テキストプロトコルに概説されているように、ポリマー中間体番号11を沈殿させます。次に、脱イオン水中でポリマー中間体をダイヤルします。サンプルを凍結乾燥して白い粉末を生成します。ミセルを調製した後、20ミリグラムのテロデンドリマーと5ミリグラムのPTXを1ミリリットルのクロロホルムに溶解します。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去し、均質な乾燥ポリマーフィルムを取得します。1ミリリットルのPBSでフィルムをボルテックスして再構成します。その後、40キロヘルツで30分間超音波処理します。3%の過酸化水素を添加して、テロデンドリマー上のチオール基を酸化します。テキストプロトコルで説明されているように、追加の準備および検証手順を実行します。ミセルの調製が完了したら、動的光散乱装置でミセルのサイズとサイズ分布を測定します。室温で測定を行い、ミセル濃度を1ミリグラム/ミリリットルに保ちます。次に、PBS中のドデシル硫酸ナトリウムの7.5ミリグラム/ミリリットルの原液を調製します。次に、PBS中のジスルフィド架橋ミセルの1.5ミリグラム/ミリリットルのストック溶液を調製します。これらのストック溶液を使用すると、最終的なSDS濃度が2.5ミリグラム/ミリリットルの混合物が作成されます。そして、ミセル濃度は1ミリリットルあたり1.0ミリグラムです。サンプルをロードし、ミセル溶液のサイズとサイズ分布を2分間隔で測定します。ヌードマウスから新鮮なクエン酸血液を収集した後、1ミリリットルの血液サンプルを1, 000 x gで10分間遠心分離し、赤血球を収集します。それらをPBSで3回洗浄し、次に細胞ペレットをPBSで最終濃度2%に再懸濁します赤血球懸濁液200マイクロリットルをPTX NCMの1ミリグラム/ミリグラム溶液と混合します。次に、200マイクロリットルの赤血球懸濁液をPTX DCMの1.0ミリグラム/ミリリットルの溶液と混合し、これらの混合物をインキュベーターシェーカーで摂氏37度で4時間インキュベートします。インキュベーションが完了した後、混合物を3, 000 x gで5分間遠心分離します。各サンプルの上清100マイクロリットルを96ウェルプレートに移します。この後、マイクロプレートリーダーを使用して、540ナノメートルの遊離ヘモグロビンの吸光度を測定します。エルマンズテストで測定したように、酸素媒介酸化の48時間後に遊離チオール基からジスルフィド結合への変換率は85%に達しました。ここでは、過酸化水素を介した酸化法が代替法として採用されています。コンバージョン率は30分で88%に達します。これは、酸素媒介アプローチの96倍の速さです。このより効率的なアプローチを使用して、50グラムを超えるナノ粒子が生成され、測定された粒子サイズは27ナノメートルで、サイズ分布は狭くなっています。PTXを装填したジスファイド架橋ミセルの安定性は、厳しいミセル破壊条件下でも調査されています。ミセルの粒子サイズは時間の経過とともに安定しており、ミセルが無傷のままであることを示しています。GSHを細胞内濃度で導入した後、薬物を充填したジスルフィド架橋ミセルのサイズは30分間そのままのままで、その後突然1ナノメートルに減少しました。これは、ミセルの急速な解離の前提条件であるジスルフィド結合の臨界数の減少を意味します。PTXをロードしたミセルの溶血活性の代表的な結果を以下に示します。PTX NCMは、用量依存的な赤血球溶解数を有する。しかし、ジスルフィド架橋を有するPTX DCMは、観察可能な溶血活性を示さない。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、別のテクニックで行うことができます。この手順を試みる際には、ジスルフィド形成のために等量の3%過酸化水素を追加することを忘れないでください。この手順に続いて、ジスルフィド架橋ミセルの血液適合性を評価するために、溶血アッセイを実施することができます。このビデオを見れば、薬物を充填したジスルフィド架橋ミセルを効果的に合成する方法を十分に理解できるはずです。これらの化学物質の一部は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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