Name: 从HIV-1感染细胞的外来体基于SILAC蛋白质组学表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习使用SILAC定量蛋白质组学方法表征HIV-1感染细胞的外泌体蛋白质组。该技术适用于多种应激或感染条件，为外泌体生物学研究提供通用工具，即使蛋白质组学背景有限的研究人员也能掌握。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究获得了Lifespan/Tufts/Brown艾滋病研究中心（CFAR）ARRA补充基金（P30AI042853-13S1）、NIH P20GM103421、P01AA019072、R01HD072693以及K24HD080539（授予BR）的资助。本研究还获得了Lifespan试点研究基金（#701-5857）、罗德岛基金会医学研究基金（#20133969）以及NIH COBRE URI/RIH试点研究基金（P20GM104317）（授予ML）的支持。我们感谢James Myall和Vy Dang在稿件撰写和图表准备过程中提供的帮助。

1. 细胞培养与HIV-1感染
注意：在开始实验之前，建议通过台盼蓝染色法11检测细胞活力，并通过MTT法12检测细胞增殖情况。使用新配制的SILAC培养基至关重要。可使用多种细胞系，只要它们处于活跃增殖阶段，并且易感HIV-1感染或适用于所选的实验条件即可。在本方案中，以H9细胞系为例进行说明。
<ol>
	<li>将 2 × 106 个 H9 细胞接种至每个细胞培养瓶中。一组细胞培养于 10 ml 标记的 RPMI 1640 培养基中，该培养基含有 10% 透析胎牛血清（FBS）、100 mg/L 13C6 L-赖氨酸和 100 mg/L 13C615N4 L-精氨酸；另一组细胞培养于 10 ml 未标记的 RPMI 1640 培养基中，含 10% 透析 FBS、100 mg/L L-赖氨酸和 100 mg/L L-精氨酸。</li>
	<li>将细胞培养至完成六次倍增，此时标记培养基中的细胞蛋白质已几乎完全被重同位素氨基酸标记（&#62;99%）。定期添加或更换新鲜培养基（每 1–3 天一次，具体频率取决于细胞类型；H9 细胞每 3 天更换一次）。在标记结束时，增加培养体积（例如 约 30 ml），以支持更多细胞的生长。 
	注意：实验开始时应通过台盼蓝染色和细胞计数确定细胞的确切倍增时间。</li>
	<li>使用标准的 HIV-1 感染方案13 对标记的细胞进行 HIV-1NL4-3 感染，持续 48 小时。将细胞与适量的病毒共同孵育，感染复数（MOI）约为 0.3。使用 HIV-1 p24 抗原 ELISA 试剂盒定量检测培养上清液中的 p24 蛋白，以评估 HIV-1 感染情况。进行免疫荧光分析14 以确认细胞感染成功。未标记的细胞继续在未标记培养基中培养，且不进行 HIV-1 感染。</li>
	<li>在感染结束时（步骤 2.1）收集两组细胞的上清液。</li>
</ol>
2. 外泌体分离
注意：通过一系列超速离心步骤，可从培养上清中富集外泌体组分15。所有以下步骤均须在 4 °C 下进行，并使用能够达到至少 100,000 × g 转速的超速离心机转子。
<ol>
	<li>将培养物的上清液收集到50 ml锥形管中，避免混入细胞。以300 × g离心10分钟，以去除残留的细胞。</li>
	<li>将上清液转移至新的50 ml锥形管中，以2,000 × g离心10分钟，以去除死细胞。将所得上清液转移至可耐受超速离心的商品化转子兼容管中。</li>
	<li>务必平衡超速离心管。以10,000 × g离心30分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>将上清液收集到超速离心管中，以100,000 × g离心70分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用5 ml新鲜PBS重悬富含外泌体的沉淀。将悬液转移至新的超速离心管中，再次以100,000 × g离心70分钟。</li>
	<li>弃去上清液。如需长期保存外泌体，可用50 µl PBS重悬沉淀，并于-80 °C保存。或者，可直接进行如下所示的蛋白质提取。</li>
</ol>
3. 蛋白质提取与制备
<ol>
	<li>将分离的外泌体沉淀物溶解于100–200 µl含蛋白酶抑制剂混合液的RIPA裂解与提取缓冲液中。该缓冲液组成为：25 mM Tris-盐酸、150 mM氯化钠、1% NP-40、1% 脱氧胆酸钠和0.1% SDS（十二烷基硫酸钠），pH值为7.6。蛋白酶抑制剂混合液应包含多种蛋白酶抑制剂，如抑肽酶（aprotinin）、亮抑酶肽（bestatin）、亮肽素（leupeptin）、胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A）和EDTA（乙二胺四乙酸），以抑制多种蛋白酶活性。</li>
	<li>将溶解后的溶液在13,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，将澄清的上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>使用二喹啉甲酸（BCA）或Bradford法测定各外泌体样品的蛋白浓度16。</li>
	<li>取标记与未标记样品中等量蛋白（2 µg）混合，将等量混合液在4–20% SDS-PAGE凝胶上以120 mA/200 V电泳30分钟。</li>
	<li>用考马斯亮蓝染色凝胶，随后进行脱色17。</li>
	<li>使用刀片从凝胶中切下样品泳道，再将凝胶条带切成10–15个等长片段，每一片段放入一个新的1.5 ml微量离心管中，共10–15个管。</li>
	<li>将凝胶小块浸入含50%乙腈的25 mM NH4HCO3溶液中，涡旋混匀，弃去上清液，重复两次。在真空浓缩仪中干燥凝胶小块18,19。</li>
	<li>用10 mM二硫苏糖醇（DTT）重悬凝胶小块，涡旋混匀，短暂离心。在56 °C孵育1小时，弃去上清液。</li>
	<li>将凝胶小块浸入55 mM碘乙酰胺溶液中，涡旋混匀，短暂离心。室温避光孵育45分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将凝胶小块浸入25 mM NH4HCO3溶液中，涡旋混匀，离心，弃去上清液。</li>
	<li>将凝胶小块浸入含50%乙腈的25 mM NH4HCO3溶液中，涡旋混匀，离心。重复步骤3.9和3.10。</li>
	<li>在真空浓缩仪中干燥凝胶小块。加入25 µl溶于25 mM NH4HCO3的测序级修饰胰蛋白酶，4 °C孵育30分钟，弃去多余溶液。将凝胶小块浸入不含胰蛋白酶的25 mM NH4HCO3溶液中，37 °C过夜孵育。</li>
	<li>短暂离心凝胶小块，将所得肽段提取液转移至新管中。向凝胶小块中加入30 µl含5%甲酸的50%乙腈溶液，涡旋30分钟，离心。将上清液与提取液合并。用真空浓缩仪将肽段提取液浓缩至体积小于5 µl。</li>
	<li>将样品送至质谱核心平台进行LC-MS/MS分析。质谱分析数据通常可通过开源软件生成，一般包括每种鉴定蛋白的登录号、标记/未标记比值以及鉴定出的独特肽段数量。</li>
</ol>
4. 蛋白质印迹验证
注意：建议使用蛋白质印迹法验证质谱结果。
<ol>
	<li>遵循标准的蛋白质印迹（Western blotting）实验流程，确保每组样品加载等量的蛋白质。使用针对目标蛋白的抗体（例如 膜联蛋白A5、乳酸脱氢酶B链）通过质谱鉴定。通过蛋白质印迹检测结合密度测定分析，可进一步验证质谱蛋白质鉴定与定量结果的准确性。</li>
</ol>
5. 蛋白质组学数据分析
注意：数据质量评估、数据预处理、计算以及显著性蛋白质候选物的确定需针对每个质谱重复样分别进行。上述分析完成后，再对各重复样的分析结果进行比较和整合6,20,21。
<ol>
	<li>评估质谱数据的质量。
	<ol>
		<li>首先，在电子表格程序中对定量蛋白质的SILAC-MS标记/未标记比值进行log2转换。</li>
		<li>在科学绘图和统计软件中，将比值划分为40–100个比值区间，并绘制每个区间内比值的数量以生成直方图。直方图呈正态分布表明质谱数据质量良好6。对所有质谱重复样本均执行此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为提高质谱肽段比值的置信度和准确性，可考虑剔除定量肽段少于两个的蛋白质。</li>
	<li>为确定显著上调和下调的候选蛋白质，请按以下步骤计算显著性阈值22。
	<ol>
		<li>在科学绘图和统计软件中，对频率分布数据进行非线性回归或曲线拟合。该步骤可得到用于计算截断值的参数。根据中位数 ± 1.96 σ 计算95%置信区间的截断值，或根据 ± 2.56 σ 计算99%置信区间的截断值。 
		注：有关截断值计算的具体细节，请参见Emmott et al.22。</li>
		<li>选择比值高于中位数1.96（或2.56）倍标准差（显著高表达）或低于中位数1.96（或2.56）倍标准差（显著低表达）的候选蛋白质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较上述筛选出的显著候选蛋白在各重复样本中的结果，以确保一致性。候选蛋白需满足以下标准方可通过最终筛选：在所有重复样本中均被一致鉴定；且其在各重复样本中的调控方向一致（理想情况下，每个候选蛋白的至少3个重复样本中有2个呈现相同方向的上调或下调）。</li>
	<li>对符合上述标准的候选蛋白，合并其各重复样本的数据，完成最终数据整理。</li>
</ol>
6. 生物信息学验证与表征
注意：现有的基因组学和生物信息学数据几乎为每种蛋白质都提供了大量信息。对这些信息进行数据挖掘和生物信息学分析，有助于深入理解重要候选蛋白的性质与功能。该过程通常对于设计合理的后续湿实验至关重要。
<ol>
	<li>利用候选蛋白的 GenBank 登录号或 UniProt ID，将其与现有的外泌体数据库（Exocarta23、Evpedia24）进行比对，以确认这些候选蛋白是否曾被发现在外泌体中存在。此步骤可进一步增强候选蛋白确实在外泌体中的可信度。
	<ol>
		<li>访问 http://www.exocarta.org/，点击“Query”，输入基因或蛋白名称/登录号。若存在相关信息，将显示摘要页面，并展示该蛋白在外泌体中的证据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将候选蛋白与 HIV-1 和人类蛋白相互作用数据库25 进行比对。或者，也可检索能够提供候选蛋白与实验条件之间相互作用信息的特定数据库。
	<ol>
		<li>访问数据库网站 www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteractions。在“protein domain name”输入框中输入候选蛋白的名称或登录号，点击搜索。搜索结果可揭示 HIV-1 与候选蛋白之间的相互作用，并提示哪些候选蛋白可能真正与 HIV-1 相关。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将候选蛋白的 GenBank 登录号或 UniProt ID 导入 GO 分析软件（如 FunRich，功能富集分析工具26），并运行该软件。
	<ol>
		<li>在 http://www.funrich.org/ 下载软件。安装后打开软件，在“enrichment analysis”下点击“Add Data Set”，上传蛋白/基因列表。随后选择图表类型以可视化 GO 分析结果。 
		注意：GO 分析结果将以饼图形式呈现。此步骤有助于我们全面了解候选蛋白在生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）方面的相关性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>访问 DAVID 网站 http://david.ncifcrf.gov/27，点击其网站上的“Functional Annotation Tool”。输入候选蛋白列表，选择基因的“Identifier”（如“UniProt ID”），选择“Gene List”并进行搜索。在“Gene_Ontology”类别下点击“Annotation Summary Results”页面，即可查看富集的 GO 条目、p 值及其他参数。</li>
	<li>为探究候选蛋白与其他蛋白之间的潜在相互作用，可使用公开可访问的 STRING 数据库28 来阐明潜在的蛋白-蛋白相互作用及可能的生化通路。 
	注意：GO 分析和功能注释（第 6.3–6.4 节）也可通过最新版本的 STRING 软件完成。
	<ol>
		<li>访问数据库网站 http://string-db.org/。将蛋白 ID 或序列输入指定的搜索框，并选择正确的物种进行分析。点击“Search”。结果将提供直接（物理）和间接（功能）关联的信息。外泌体候选蛋白的前十个已知匹配结果将被显示，应将其纳入重要候选蛋白的筛选考虑范围。 
		注意：通过上述步骤可分析与候选蛋白相关的大量信息。可从中选择最具显著性的候选蛋白，用于后续的分子和生化分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+function%3A+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Booth, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+HIV+Gag+bud+from+endosome-like+domains+of+the+T+cell+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane.</a> J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).</li>
<li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343 (6171), 653-656 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+exosomes+from+HIV-1-infected+lymphocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells.</a> Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Anderson, L., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.</a> Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+MTT+lymphocyte+proliferation+assay+for+the+diagnosis+of+neurocysticercosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis.</a> J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).</li>
<li>Cepko, C., Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+infection+of+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).</li>
<li>Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+immunofluorescence+assay+for+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus.</a> J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).</li>
<li>Olson, B. J. S. C., Markwell, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlson%2C+BJSC+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining+for+high+sensitivity+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteom%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics.</a> J Proteom. 90, 96-106 (2013).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+the+comparative+analysis+of+multiprotein+complexes+based+on+15N+metabolic+labeling+and+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+binding+protein+is+a+multifaceted+cellular+regulator+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication.</a> J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).</li>
<li>Li, M., Ramratnam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Characterization+of+Exosomes+from+HIV-1-Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells.</a> Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).</li>
<li>Emmott, E., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interaction+partners+in+mammalian+cells+using+SILAC-immunoprecipitation+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta%3A+A+Web-Based+Compendium+of+Exosomal+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EVpedia%3A+a+community+web+portal+for+extracellular+vesicles+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research.</a> Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1%2C+human+protein+interaction+database+at+NCBI%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI.</a> Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).</li>
<li>Pathan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunRich%3A+An+open+access+standalone+functional+enrichment+and+interaction+network+analysis+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool.</a> Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2011%3A+functional+interaction+networks+of+proteins%2C+globally+integrated+and+scored%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored.</a> Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+pure+are+your+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1%3A+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).</li>
<li>Chertova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+biochemical+analysis+of+purified+human+immunodeficiency+virus+type+1+produced+from+infected+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages.</a> J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).</li>
<li>Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview.</a> Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本文所述的实验流程中，我们展示了如何应用SILAC技术研究HIV-1感染对宿主细胞外泌体蛋白质组的影响。首先，对未感染和HIV-1感染的细胞进行差异性同位素标记。随后，分离带有不同标记的细胞外泌体，并进行蛋白质提取。接下来，采用液相色谱-串联质谱法分析细胞外泌体的蛋白质组。最后，对获得的质谱数据及潜在候选蛋白进行统计学和生物信息学分析，再开展下游的生化深入研究。
在整个实验方案中，必须遵循若干关键步骤才能获得优化的结果。在实验的初始阶段，SILAC标记可能受到细胞类型和标记培养基的影响。应使用状态良好且增殖活跃的细胞，以实现高效的标记效果。关键的是，标记培养基应使用透析胎牛血清（FBS）而非普通FBS新鲜配制。透析FBS中的氨基酸和肽类已被去除，因此更不易干扰SILAC标记过程。然而需要注意的是，透析血清可能并不适用于某些细胞系，尤其是原代细胞。在采用SILAC策略之前，应先确认细胞在含透析FBS的培养基中能够正常生长。此外，使用双倍 &#34;重&#34; 同位素标记13C6 L-赖氨酸和 13C6</...

许多人类疾病（包括病毒感染）通常与受累细胞内部及周围发生的独特细胞过程相关。蛋白质通常作为细胞的最终效应分子，介导这些过程。对蛋白质的分析往往能够提供有关病变细胞局部环境的宝贵信息，并有助于我们理解疾病发病机制的内在机理。在众多蛋白质分析技术中，蛋白质组学具有尤为广阔的应用前景。作为一种强大的高通量工具，蛋白质组学能够系统性地揭示细胞过程，特别是在蛋白质功能与相互作用领域。随着标记技术的发展，特定蛋白质的分析变得更加简便，这些技术使研究人员能够在目标部位监测细胞组分（尤其是蛋白质）的表达情况。尽管已有大量蛋白质组学研究在全细胞蛋白质组水平上开展，但针对亚细胞结构的蛋白质组学表征被证明具有特别重要的信息价值1。HIV-1感染的研究便是其中的典型例证。
外泌体是由多种细胞类型分泌的直径为30-100 nm的膜性小泡2,3，是细胞间通讯和分子转运的关键组分。先前研究发现，外泌体在HIV-1出芽过程中发挥重要作用4,5。通过整合蛋白质组学分析与功能解析，我们发现来自HIV-1感染细胞的外泌体具有独特且定量差异的蛋白质特征，并携带调控分子，可影响邻近受体细胞的细胞特性，包括细胞凋亡和增殖6。本实验方案详细描述了基于SILAC（细胞培养中氨基酸稳定同位素标记）7的HIV-1感染细胞来源外泌体的蛋白质组学表征方法。通过调整实验刺激条件以针对特定的亚细胞结构或组分，并对所述实验步骤进行必要修改，类似方法也可用于更深入地研究病原体致病过程中其他亚细胞区域的特性。
随着定量蛋白质组学方法的近期发展，在为特定实验选择最高效方法时有了多种选择。其中主要包括基于化学试剂的iTRAQ（同重标签相对与绝对定量）8 和无标记的MRM（多反应监测）9 技术。这两种方法均为强大的工具，在特定实验条件下是理想的选择。然而，对于主要使用细胞系的典型实验室而言，与基于SILAC的方法相比，这两种方法的成本相对较高，且耗时更长。SILAC是一种基于代谢标记的技术，通过培养基中的非放射性同位素标记氨基酸将其掺入细胞蛋白质中。通常，SILAC实验始于两组细胞群体，例如感染与未感染细胞。每组细胞在各自特定的同位素环境中进行差异标记，直至完成完全标记。随后，提取这些细胞的外泌体蛋白。蛋白提取完成后，利用液相色谱-串联质谱技术10对标记的外泌体蛋白进行分析。最后，对质谱结果及显著标记的蛋白质进行统计学与生物信息学分析，并辅以严格的生化验证。我们先前的研究报告表明，SILAC/外泌体流程相较于原代细胞更适用于细胞系，因为细胞系通常处于活跃增殖状态，有利于实现高效的同位素标记。

<table><tbody><tr><td>H9 细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-176</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>MTT 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>透析胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>SILAC 蛋白定量试剂盒 &amp;ndash; RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher</td><td>89982</td><td>DMEM 版本 (89983)</td></tr><tr><td>L-盐酸精氨酸，&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;，&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，用于 SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88434</td><td></td></tr><tr><td>L-盐酸赖氨酸，&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;，用于 SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88431</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3</td><td>NIH 艾滋病试剂计划</td><td>2480</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 抗原 ELISA 检测试剂盒</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>制冷型超高速离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22628045</td><td></td></tr><tr><td>制冷型超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td>应能达到 100,000 × g</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Thermo Fisher</td><td>&amp;nbsp;78430</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Biorad</td><td>1702525</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 凝胶电泳装置</td><td>Thermo Fisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris-甘氨酸迷你凝胶</td><td>Novex</td><td>XV04200PK20</td><td></td></tr><tr><td>凝胶染色试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 浓缩仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>抗人膜联蛋白 A5 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab14196</td><td></td></tr><tr><td>抗人乳酸脱氢酶 B 链抗体</td><td>Abcam</td><td>ab53292</td><td></td></tr><tr><td>绘图与统计分析软件</td><td>Systat&amp;nbsp;</td><td>SigmaPlot&amp;nbsp;</td><td>或 GraphPad Prism</td></tr><tr><td>定量蛋白质组学软件套件</td><td>马克斯·普朗克生物化学研究所</td><td>Maxquant&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>软件与数据库</td><td>多个供应商</td><td></td><td>详见正文</td></tr></tbody></table>

基于silac的hiv-1感染细胞外泌体蛋白质组学表征

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

蛋白质组学是对蛋白质进行的大规模分析。蛋白质组学技术（如液相色谱-串联质谱法，LC-MS/MS）可同时鉴定数千种蛋白质。这些强大的技术使我们能够系统地理解细胞在受到各种刺激（如感染、应激和特定实验条件）时发生的细胞变化。尽管近年来已有进展，分析外泌体蛋白质组仍然耗时，且通常涉及复杂的方法。此外，所产生的大规模数据集通常需要进行稳健且高效的分析，以便研究人员开展后续的下游研究。本文介绍了一种基于稳定同位素标记氨基酸（SILAC）的方法，用于表征HIV-1感染细胞后外泌体的蛋白质组。该方法基于简单的同位素标记，从不同标记的细胞中分离外泌体，并进行质谱分析，随后对蛋白质组学检测结果进行详细的数据挖掘和生物信息学分析。所得数据集和候选蛋白易于理解，通常可为下游分析提供丰富的信息。该方案同样适用于其他亚细胞结构和多种实验条件。

图1A 是概述SILAC标记流程的流程图21。为了纯化外泌体，样品必须通过离心机离心沉淀。图1B 展示了通过连续超速离心纯化外泌体的步骤21。纯化完成后，外泌体将按照所述实验流程进行蛋白质组学分析。
图2A 是从蛋白质组学数据中确定显著性候选蛋白的流程图21。所筛选出的候选蛋白将用于后续的蛋白质组学分析。图2B 为SILAC直方图示例，显示了典型蛋白质定量结果的代表性比值（该图已根据Li et al.6 修改），而表1 则为根据这些SILAC比值直方图确定显著性候选蛋白截断值的示...

本文介绍了一种定量蛋白质组学方法，该方法采用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记技术（SILAC），用于分析HIV-1感染对宿主外泌体蛋白质组的影响。该方案可轻松适用于处于不同应激或感染条件下的细胞。

基于SILAC的HIV-1感染细胞外泌体蛋白质组学表征

蛋白质组学是对蛋白质进行的大规模分析。蛋白质组学技术，如液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可以……

本实验的总体目标是对 HIV-1 感染细胞来源的外泌体蛋白质组进行表征。该方法有助于解答外泌体生物学领域中的关键问题，例如外界应激因素对外泌体蛋白质组组成的影响。该技术的主要优势在于，即使在蛋白质组学和外泌体生物学背景知识有限的情况下，也能够掌握并应用。尽管该方法可为HIV感染研究提供见解，但也适用于其他疾病研究，例如细菌感染。本实验使用H9细胞系，但只要细胞处于活跃增殖阶段且对所选测试条件敏感，也可使用其他多种细胞系。将两乘以十的六次方个H9细胞分别接种至两个细胞培养瓶中。将一个细胞群体培养于10毫升含10%胎牛血清（FBS）、100毫克/升C13标记的L-赖氨酸以及100毫克/升C13和N15标记的L-精氨酸的标记培养基中。将另一个细胞群体培养于10毫升不含同位素标记的培养基中，其中含有10%胎牛血清（FBS）、未标记的L-赖氨酸和L-精氨酸。细胞培养至经历六次倍增，此时标记培养基中的细胞蛋白质已被重同位素氨基酸标记的比例超过99%。根据细胞类型，定期添加新鲜培养基或更换培养基。标记结束时，将培养体积增加至 30 毫升，以适应更多细胞的生长。使用标准的 HIV-1 感染方案，用 HIV-1 的 NL4-3 毒株感染已标记的细胞。向细胞中加入适量病毒，并孵育48小时，同时未标记的细胞在未添加HIV-1的培养基中继续生长。HIV-1感染结束后，收集两组细胞的上清液用于外泌体分离。将培养物的上清液收集至50毫升锥形管中，注意避免混入细胞。在300 × g、4 °C条件下离心10分钟，以去除残留细胞。将上清液收集至新的50 mL锥形管中，在2,000 × g条件下离心10分钟，以去除死细胞。将所得上清液转移至可耐受超速离心的商品化转子兼容管中。务必平衡超速离心管。以10,000 × g离心30分钟，以去除细胞碎片。将上清液收集到新的超速离心管中。在100,000 × g条件下离心70分钟，弃去上清液。将每个富含外泌体的沉淀重悬于5毫升新鲜PBS中，并将溶液转移至新的超速离心管中。再次在100,000 × g条件下离心70分钟。最后一次离心后，弃去上清液。此时细胞沉淀已准备好进行蛋白质提取。开始此操作时，将每个分离得到的外泌体沉淀溶解于 100 至 200 微升含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，该抑制剂可抑制多种蛋白酶的活性。将溶解后的溶液在 4°C 条件下以 13,000 × g 离心 10 分钟。将澄清的上清液转移至新的 1.5 毫升微量离心管中。通过标准检测方法测定每个样品的蛋白浓度后，将标记和未标记样品的等量蛋白质混合。将等量混合物在4%至20%的SDS-PAGE凝胶中电泳30分钟。用考马斯亮蓝染色凝胶，随后进行脱色。使用剃刀刀片从凝胶上切下样品泳道，然后将凝胶泳道切成10至15个大小相等的小块。每块放入一个全新的1.5毫升微量离心管中，共10至15个管，随后按照文本方案中所述的蛋白质提取步骤继续操作。蛋白质组学数据分析的步骤将不在此演示，但其流程总结于以下流程图中。首先通过液相色谱-串联质谱法分析提取的蛋白质，并评估数据质量。接着，通过去除定量肽段少于两个的蛋白质对数据进行预处理。然后鉴定显著上调和显著下调的蛋白质。最后，比较显著候选蛋白的重复实验结果以确保一致性，并合并所有重复实验的数据。为了开始对已鉴定蛋白进行表征，可利用其GenBank登录号或UniProt ID，在现有的外泌体数据库中进行检索。本演示中将使用ExoCarta数据库。点击查询并输入基因或蛋白质名称或登录号。任何关于外泌体的证据均证实候选蛋白质此前已在外泌体中被发现，这进一步增强了候选蛋白确实存在于外泌体中的可信度。接下来，将候选蛋白与HIV-1和人类蛋白质相互作用数据库进行比对搜索。在蛋白质结构域名称输入栏中，输入候选蛋白的名称或登录号，然后点击搜索。搜索结果可提供有关 HIV-1 与候选蛋白之间相互作用的信息，并提示哪些候选蛋白可能真正与 HIV-1 相关。第三步是使用基因本体（gene ontology，GO）分析软件（如 fun-rich）对候选蛋白进行全局性分析，以获得整体功能信息。在富集分析中，点击“添加数据集”并上传候选蛋白的 GenBank 登录号或 UniProt ID，然后选择图表类型以可视化 GO 分析结果。GO 分析结果以饼图形式展示，提供候选蛋白在生物过程、细胞组分和分子功能三个方面的信息。下一步是通过 DAVID 分析鉴定在统计学上显著富集的 GO 条目。单击功能注释工具，输入候选基因列表，并选择基因的标识符，例如 UniProt ID。选择基因列表并进行搜索。搜索完成后，单击基因本体（gene ontology）类别下的注释摘要结果页面，以查看富集的 GO 条目、p 值及其他参数。最后，利用公开可访问的 STRING 数据库分析潜在的蛋白质-蛋白质相互作用及可能的生物化学通路。将蛋白质 ID 或序列输入指定的搜索框中，并选择正确的物种进行分析。点击搜索。结果将提供有关直接和间接关联的信息。在结果中显示的外泌体候选蛋白的前10个已知匹配项应被考虑用于重要候选物的筛选。图中展示了对一组14种蛋白质进行DAVID分析的代表性结果。生物学过程富集分析表明，与细胞死亡相关的过程显著富集。细胞组分富集分析显示，许多蛋白来源于细胞内，而分子功能富集分析则表明大多数候选蛋白具有蛋白质结合功能。其中，L-乳酸脱氢酶B链（LDHB）被选为最显著的候选蛋白，STRING分析鉴定了LDHB的前10个相互作用蛋白。这些LDHB相互作用蛋白中的大多数在功能和定位上也与HIV-1中的外泌体相关。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一周内完成。在进行该实验时，重要的是要牢记在适当的温度和条件下执行每一步骤。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法（如亲和分离）来验证生物信息学分析的预测结果。该技术建立后，为外泌体领域研究HIV-1感染相关的外泌体蛋白质组变化开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从细胞培养物中分离外泌体、分析其蛋白质组，并探究其与HIV的关系。请务必注意，操作HIV或其他传染性病原体具有极高危险性，在进行此类实验时，必须采取佩戴个人防护装备等安全防护措施。

silac-based-proteomic-characterization-exosomes-from-hiv-1-infected

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从HIV-1感染细胞的外来体基于SILAC蛋白质组学表征

本文展示了外泌体的分离、纯化与检测方法，以及对其分子成分进行分析的技术。这些方法适用于从细胞培养上清和生物体液中分离外泌体，不仅可用于分子成分分析，也可用于功能研究。...

含RNA外泌体的分离与表征

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

基于肽段的功能基序及其结合伴侣的鉴定

使用SILAC-免疫共沉淀定量蛋白质组学鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用伙伴

本文描述了一种利用梯度方法分离外泌体与人类免疫缺陷病毒（HIV）颗粒的技术。该方法用于从HIV感染者的人体血浆中将外泌体与HIV颗粒分离。随后对分离得到的外泌体进行了细胞因子/趋化因子含量分析。...

从HIV-1阳性个体血浆中分离外泌体

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。...

脂滴分离用于定量质谱分析

本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+...

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4+ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

本方案通过结合细胞外囊泡（EV）沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获技术，高效且高得率地将细胞外囊泡与病毒颗粒分离，从而实现简化的操作流程并降低起始样本体积需求，最终获得可重复的细胞外囊泡制备物，适用于所有细胞外囊泡相关研究。...

高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。...

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

本文介绍了一种在纳米流体装置上对单个细胞进行监测以研究急性事件及有效的HIV-1感染的实验方案。成像数据可明确病毒与宿主受体之间的相互作用以及信号通路的动力学变化。这是首个用于高通量、纵向单细胞培养与成像的纳米流体技术方法，可用于研究信号动力学和分子相互作用。...

基于多参数光流控平台的单细胞钙离子内流与HIV-1感染表征

本文介绍了一些用于检测内质网（ER）应激及未折叠蛋白反应（UPR）激活的成熟方法，特别侧重于在HIV-1感染中的应用。此外，本文还描述了一系列用于研究内质网应激/UPR对HIV-1复制及病毒颗粒感染性影响的实验方案。...

测量HIV-1感染T细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在HIV-1复制中的作用分析

学习使用SILAC定量蛋白质组学方法表征HIV-1感染细胞的外泌体蛋白质组。该技术适用于多种应激或感染条件，为外泌体生物学研究提供通用工具，即使蛋白质组学背景有限的研究人员也能掌握。

基于SILAC的HIV-1感染细胞外泌体蛋白质组学表征

探索更多视频