3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

本手法によるカスタマイズされたハイドロゲルの作製は、肺の細胞外マトリックスの複雑性を再現した細胞および培養条件を研究することを全体の目的としています。この手法は、健康な状態および病理学的状態において肺細胞がどのようにECMと相互作用するかといった、肺疾患分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の主な利点は、肺ECMハイドロゲルを2Dまたは3D培養における用途に合わせて調整可能であることです。

一般的に、この手法を初めて行う方は、脱細胞化技術の複雑さから苦労することがあります。生存組織の量を最適化するためには、時に複数人の人員と細心の注意が必要となります。本プロトコルでは、脱細胞化のためのブタ肺を用意してください。準備に関する詳細は、テキストプロトコルで確認できます。

肺の準備が完了したら、肺動脈に適合するようにカニュレートされたハンドポンプを使用します。まず、血管系に約1リットルの水を灌流し、次に気管に1.5リットルの水を灌流します。細胞破片が除去されるにつれて灌流する水の量を増やしながら、この操作を3回繰り返します。

次に、同様にハンドポンプを用いて、組織をTriton X-100で灌流します。その後、組織を4 °CのTriton X-100溶液のバスに24時間浸漬させます。24時間後、血管系と気管を蒸留水で3回洗浄します。

洗浄後、ハンドポンプを使用して組織にデオキシコール酸を灌流させます。その後、組織をデオキシコール酸に浸し、4°Cで24時間静置します。翌日、前述と同様に、組織を蒸留水で3回洗浄します。

洗浄後、ハンドポンプを使用して、ろ過した塩化ナトリウムで組織を灌流させます。次に、組織をろ過した塩化ナトリウムに浸し、4°Cで1時間保持します。浸漬後、血管系と気管を蒸留水で3回灌流し、洗浄します。

洗浄後、組織をDNase溶液で灌流し、その後4°Cで1時間DNase溶液に浸漬させます。1時間後、水ではなくPBSを用いて血管系と気管を5回灌流します。次に、不透明な白い組織のみを用い、直径2mm以上のすべての細管を切り出します。

これらは主に肺門および肺の内側部分に見られます。主に末梢に位置する呼吸領域はそのままにしておきます。細管を除去した後、組織を1インチまたはそれ以下の大きさに切断します。

これらのブロックの向きは重要ではありません。組織ブロックの水気を切った後、50 mLコニカルチューブに移し、-80 °Cで凍結させます。細胞やデブリの除去を確認するため、いくつかのブロックを組織学的検査用に取り分けておいてもかまいません。

肺組織を脱細胞化粉末に処理するために、冷凍組織チューブの蓋をフィルターペーパーに替えて、ゴムバンドで固定します。次に、製造元の指示に従って凍結乾燥機を使用し、余分な液体がすべてなくなるまで組織を凍結乾燥させます。その後、粉砕できるまで組織を-80°Cで保存します。

ミルを準備するために、まず液体窒素を注入し、ミルチューブを入れるためのスペースを確保します。次に、ミルチューブから磁性ミルバーを取り出し、チューブの底を組織で覆います。その後、ミルバーを戻し、チューブがいっぱいになるまでさらに組織を緩めて詰めます。

次に、ミルチューブを閉じ、フリーザー/ミルに設置し、液相窒素を最大容量まで満たします。その後、衝撃回数を毎分約600回に設定し、約5分間ミルを運転させます。次いで、脱細胞化粉末を必要時まで-80 °Cで保存します。

プレゲル材料を作成するには、脱細胞化組織パウダーとペプシンをコニカルチューブに加えます。次に、脱細胞化組織パウダーの最終濃度が1%、ペプシンの最終濃度が0.01%になるように、0.01 molar 塩酸をチューブに加えます。組織を消化させるため、この溶液を室温で48時間、絶えず攪拌し続けます。

48時間後、溶液を氷上で5分間静置します。次に、冷たい0.1 M 水酸化ナトリウムを用いて溶液のpHを7.4に調整し、10X PBSを添加してPBS濃度を1Xにします。なお、プレゲルの処理時間やpHを変更した経験があります。

使用可能な範囲にはある程度の柔軟性がありますが、手順をわずかに変更するだけで特性が劇的に変化する可能性があります。この溶液はプリゲルとは見なされず、未処理プレートにコーティングして細胞を表面で培養するためのハイドロゲルを形成したり、細胞を内部で培養するためのハイドロゲルを形成したりすることに使用できます。また、ハイドロゲルを形成する前にさらに修飾することで、ハイドロゲルの剛性を高めることも可能です。二次元の微多孔性ゲルコーティング上で細胞を培養するには、未処理の96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、プリゲル溶液を20 µL添加してください。

その後、タンパク質がプレートに吸着するように、プレートを4°Cで一晩冷却します。翌日、プレゲル溶液を吸引し、ウェルをPBSで洗浄します。次に、各ウェルに3,200個の細胞を加え、各ウェルの培地量を100 µLまで満たします。

その後、プレートをインキュベートします。微多孔性ゲル内に細胞を封入する三次元細胞培養を行う場合は、目的の細胞をプリゲル溶液中で10^6 cells/mLの濃度で再懸濁します。次に、細胞懸濁液16 µLを96ウェルプレートの各ウェルに速やかに分注し、厚さ約500 µmの3D細胞培養体を形成させます。

37 °Cでインキュベートすると、30分でゲルが形成されます。ゲルが形成された後、ウェルの100 µLの標線まで培地を加えます。微多孔性ゲルの上に細胞を配置する三次元細胞培養を行う場合は、未処理の96ウェルプレートのウェルに、プリゲル溶液を100 µL加えます。

次に、プレートを37 °Cで30分間インキュベートし、ゲル化させます。ゲルが形成されたら、ハイドロゲルの上に100 µLの培地に含まれる3,200個の細胞を添加し、プレートのインキュベーションを継続します。ハイドロゲルは、上述の方法を用いて正常なブタ、ラット、およびマウスの肺から作製しました。

レオロジー試験により、37 °Cに到達した後の最初の数分間にゲルの形成が90%以上起こることが確認されました。形成されたハイドロゲルはPBS中で長期間安定していましたが、細胞の接着および増殖は時間とともに変化する可能性があります。細胞接着を改善するためのコーティングとして、プレゲル溶液の試験が行われました。

ヒト臍帯静脈内皮細胞の接着および増殖をMTTSアッセイを用いて測定しました。ウェルをECMでコーティングすることで改善が認められました。3Dゲルの作製において、Genipinを添加することでハイドロゲルの架橋度が高まりました。

レオメーターを用いた周波数掃引により、ハイドロゲルの剛性はGenipin濃度と直接的な相関があることが示され、中央値および最も適切な濃度は0.01%でした。より剛性の高いゲルを用いた試験では、MTTSアッセイにより、架橋密度の高いゲルで細胞増殖率が高いことが測定されました。習熟後、脱細胞化は4日間で計8時間で完了できます。前ゲル溶液は2日間で計1時間で調製でき、ゲルの形成は2日間で計2時間で完了します。

この手順に続き、弾性率、タンパク質組成、および材料に対する細胞応答などの追加の疑問を解明するために、AFM、ウェスタンブロット、染色、免疫組織化学などの他の手法を実施することができます。