Name: Geoptimaliseerd Analyse van In Vivo en In Vitro Leversteatose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer geoptimaliseerde methoden voor het genereren en karakteriseren van leversteatose met in vivo- en in vitro-benaderingen. Deze technieken bieden niet-invasieve beoordeling van metabole ziekten zoals vetleverziekte en diabetes type II.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We waarderen Feifei Zhang voor de nuttige discussies. We zijn dankbaar aan Jing Gao en Yixuan Sun voor de technische assistentie en aan Zhengshuai Liu en Fengguang Ma voor de dierstudies.

Alle dierlijke experimentele protocollen werden goedgekeurd door de institutionele dierlijke zorg en het gebruik commissie aan het Instituut voor Nutritional Sciences, Shanghai Institutes voor Biologische Wetenschappen, de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). 1. DIO muismodel <ol><li> HFHS voeden <ol><li> Voer de acht weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen met een HFHS dat 40% kcal vet en 40 kcal% sucrose bevat. Huisvesten ze in 12 uur donker-licht-cyclus omstandigheden. </li><li> Houd de muizen in HFHS voeding geeft voorwaarde voor 4-16 weken. Controleer het lichaamsgewicht per week. </li></ol></li><li> Analyse van de lichaamssamenstelling en pseudo-color beeldanalyse <ol><li> Betreft de muizen om een ​​samenstelling analyzer lichaamsanalyse. <ol><li> Secure bewust, niet verdoofd muizen in een plastic buis in het. Meet de vetmassa, vetvrije massa, en vloeistoffen met behulp van een NMR-systeem, zoals eerder 2 beschreven. </li></ol></li><li> Scan het geheel van elke muis met een MRI systeem. <ol><li> Verdoven de muizen met 1% Avertin via intraperitoneale injectie (25 ul / g) en voer de beeldverwerkingsanalyses gespecialiseerde glasbuizen. Opmerking: Het proces van beeldvorming duurt ongeveer 0,5 uur voor elke muis. Als de meting is voltooid, keren de muizen hun kooi. </li></ol></li><li> Scan de gehele organen van de muizen in dorsale, midden en ventrale lagen; scan de lever in de verticale richting. Gebruik een 0,55 T magneet en de volgende instrumentele parameters: K ruimte = 192 x 256 micrometer, coupedikte = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, en het aantal scans = 8. Scan met dezelfde magnetische voorwaarde voor alle groepen muizen. </li><li> Wijs de grijswaardenafbeelding pseudo-color beeld op basis van de intensiteit van het signaal 9. </li></ol></li><li> muis euthanasie <ol><li> steriliseren dissecting hulpmiddelen, zoals een tang en schaar. </li><li> Giet voldoende isofluraan op een papieren handdoek en laat de isofluraan vervluchtigen in een glazen pot. Zorg ervoor dat de muizen gedood door de isofluraan. </li><li> Bevestig de muizen op een operatietafel. Spray elk buik met 75% ethanol, een insnijding in de huid van de processus xiphoideus met een schaar en scheur de dermis lengterichting door de middellijn met de handen om het buikvlies bloot. </li><li> Klem de processus xiphoideus met een tang en snijd het buikvlies breedterichting door de bodem van de ribben om de ingewanden bloot te leggen. </li><li> Verzamelen van bloed in EDTA-gecoate buizen door hartpunctie. </li><li> Snijd het membraan langs de lever en verwijder voorzichtig de lever van de enterocoelia met behulp van fijne schaar. Snijd drie stukjes leverweefsel de volgende lipidenbepaling: a) 6 x 3 x 3 mm voor H &amp; E kleuring, b) 6 x 3 x 3 mm voor Oil Red O kleuring, en c) 20-40 mg lever chloroform / methanolextractie. </li></ol></li><li> H &amp; E-kleuring <ol><li> Bevestig de lever in 4% fosfaat gebufferde formaline acetaat bij 4 ° C geïncubeerd en daarna inbedden in paraffine. </li><li> Snijd paraffinecoupes (5 urn) en brengen ze op glasplaatjes voor H &amp; E kleuring zoals eerder beschreven 3, 10. </li></ol></li><li> Oil Red O kleuring <ol><li> Regent voorbereiding <ol><li> Bereid Oil Red O werkende oplossing met 10% formaline, 60% isopropanol, Hematoxylin en glycerol gelei. Los op 0,5 g Oil Red O poeder met 100 ml isopropanol en verwarm het in een 60 ° C bad een 0,5% voorraadoplossing te maken. </li><li> Verdun met dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O) in een 3: 2 verhouding (3 ml stock-oplossing en 2 ml van DDH 2 O). Filtreer de werkoplossing en laat gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Insluiten de lever in optimale snij-temperatuur (LGO) verbinding in aplastic inbedding doos. Bevriezen bij -20 ° C gedurende 30 minuten. Snijd het in 8-um secties in een bevriezing microtoom, monteer het weefsel op een dia, en plaats het bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Plaats een papieren handdoek op de bodem van een kleuring bad en giet een kleine hoeveelheid 10% formaline de papieren handdoek nat. Plaats de dia in de kleuring bad en bevestig de ingevroren secties in formaldehyde dampen gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Dompel de dia in 60% isopropanol in de kleuring tub voor 3 s; herhaal eenmaal. </li><li> Voeg enkele druppels Oil Red O werkoplossing de slede alle weefselbedekking en incubeer gedurende 15 minuten. Bescherm het weefsel van licht bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel de dia in nieuwe 60% isopropanol in de kleuring tub voor 3 s; tweemaal herhalen. </li><li> Voorzichtig spoelen de schuif door gedestilleerd water twee keer en verwijder het water rond het weefsel. Zorg ervoor dat het weefsel niet te drogen. </li><li> Plaats de dia in Hematoxylin gedurende 1 minuut en spoel voorzichtig met kraanwater voor 5-10min. Voorzichtig spoelen de schuif in gedestilleerd water twee keer en houden het in gedestilleerd water totdat klaar om op de dekglaasje te zetten. </li><li> Verwarm de glycerol gelei in de magnetron en plaats een paar druppels in het weefsel. Plaats voorzichtig de dekglaasje op de top en de zorg niet om bellen te vormen. </li><li> Let op de vlek onder een microscoop en vast te leggen karakteristieke foto&#39;s met behulp van 20X en 40X doelstellingen. </li></ol></li><li> Meting van de lever lipiden <ol><li> Plaats de uitgesneden leverweefsel in een nieuwe 2 ml plastic centrifugebuis. Homogeniseer in 1 ml PBS met een homogenisator en zet het lysaat naar een nieuwe 15-ml glazen buis. </li><li> Voeg 5 ml chloroform / methanol (2: 1, v / v) oplossing, vortex het mengsel krachtig gedurende 1 min, en laat gedurende 2 uur op ijs. </li><li> Centrifugeer bij 1650 xg gedurende 10 min bij 4 ° C; dient het mengsel te scheiden in 3 lagen: de bovenste laag methanol, de middelste eiwit schijf en de bodem chloroform en lipiden. </li><li> Tran<html> Sfer de onderste fase in een nieuwe glazen buis met een glazen Pasteur pipet; er is geen noodzaak om elke druppel van de bodemfractie krijgen. Zet de buis opzij op ijs. </li><li> Voeg 600 ul van 4 mM MgCl2 en 1,5 ml chloroform aan de fractie supernatant links in de vorige buis en vortex krachtig. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten en centrifugeer bij 1650 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Combineer de onderste fase met de eerste onderste fase buis met behulp Pasteur pipet. Gooi de bovenste en middelste lagen. </li><li> Damp het chloroform onder stikstofgas in een 37 ° C bad. Was de zijkanten van de glazen buizen grondig met 200 ui 1% Triton X-100 / chloroform (v / v). Verdampen onder stikstofgas. Los het lipide bij 200 pl DDH 2 O en vortex goed op de uiteindelijke emulsie. </li><li> Meet de totale triglyceride (TG) en cholesterol (TC) niveaus met een triglyceride of cholesterol kit volgens het protocol van de fabrikantxref &quot;&gt; 3. OPMERKING: De lipide waarden zijn genormaliseerd aan die van de eiwitconcentraties in de initiële homogenaat, zoals bepaald door kwantificatie 3 eiwit. </li></ol></li></ol> 2. Primaire Mouse Hepatocyt Model <ol><li> Isolatie van de muis primaire hepatocyten <ol><li> Verdoven elke muis met 6% chloraalhydraat (10 pl / g intraperitoneaal). </li><li> Isoleer primaire hepatocyten, zoals eerder beschreven 10. Kweek cellen op met collageen beklede dekglaasjes in een 6-wells plaat Oil Red O kleuring. Voor vetextractie, het zaad van de cellen op een 10-cm celkweek schotel 10. </li></ol></li><li> Cel behandeling en Oil Red O kleuring <ol><li> Vervang het medium met 2 ml uitputtingsmedium en incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur. Behandelen met 30 mM glucose en 100 nM insuline. Incubeer in een 37 ° C incubator gedurende 24 uur. </li><li> Zuig het medium. Voeg 2 ml PBS en schud zachtjes aan het medium te spoelen; herhaal eenmaal. </li><li> Bevestig de dekglaasje aan de dia met een rubberen band. Maak de cellen hechtend aan het buitenoppervlak. Voer de Oil Red O kleuring zoals hierboven (stap 1,5) beschreven. LET OP: De basale niveaus van lipide-accumulatie worden gestimuleerd met een hoog glucosegehalte plus insuline behandeling na serum uithongering. De lipide druppels worden gevisualiseerd door Oil Red O kleuring. </li></ol></li><li> Meting van lipiden <ol><li> Behandel de hepatocyten met een hoge glucose plus insuline in dezelfde staat (stap 2.2.1). Voeg 1 ml PBS aan elk 10-cm celkweek schotel. Afschrapen van de cellen en oogsten tot nieuwe 15-ml glazen buizen, waaruit fracties van 100 pl wordt overgebracht op vers 1,5 ml buizen voor eiwit kwantificatie. </li><li> Voeg 4 ml chloroform / methanol (2: 1, v / v) om de resterende 900 pi cellen. Sonificeer ongeveer 20 pieptonen en vervolgens vortex krachtig vrij te gevenhet lipide in de cellen. Incubeer het mengsel op ijs gedurende 2 uur. Voer de lipide-extractie (stap 1.6). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Angulo, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11961152">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li>
<li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li>
<li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li>
<li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fatty+liver+disease%3A+old+questions+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li>
<li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li>
<li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li>
<li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23507799">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen. Financiering: Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr 81270930, 31471129 en 31671224) en de honderd talenten Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (2013OHTP04) naar YL

NAFLD is een reeks van progressieve leverziekten die is geassocieerd met het metabool syndroom, obesitas, insulineresistentie en type 2 diabetes mellitus (T2DM) 11. Het kenmerk van NAFLD is steatosis, de accumulatie van lipiden in hepatocyten. Hier wordt een scala aan werkwijzen voorgesteld aan de fenotypes en parameters van leversteatose gebruik DIO muizen en primaire hepatocyten karakteriseren. Deze procedure kan nuttig zijn om de moleculaire mechanismen van NAFLD en andere verwante metabolisch...

Obesitas is een groeiende gezondheidsprobleem in ontwikkelde landen en ontwikkelingslanden. Vermeld is een van de bestaande afwijkingen vaak geassocieerd met niet-alcoholische steatohepatitis (NAFLD), met een prevalentie variërend tussen 30 en 100 procent in NAFLD patiënten 1. Door de sterke correlatie tussen leververvetting en obesitas, zijn dieet-geïnduceerde zwaarlijvige (DIO) muismodellen wijd gebruikt om de complexe moleculaire mechanismen van de ontwikkeling van NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 bestuderen. Hepatische steatosis het beginstadium van NAFLD, en kan ontwikkelen tot non-alcoholische steatohepatitis (NASH), cirrose, en uiteindelijk, leverkanker 7. Daarom is de algemene doelstelling van deze methode is om dierlijke en mobiele modellen van de lever steatotic voorwaarden te genereren en provide gedetailleerde protocollen voor het efficiënt en nauwkeurig lipide-meting. Deze modellen en afmetingen zijn ook bruikbaar voor het onderzoeken van andere metabole aandoeningen zoals insulineresistentie en type 2 diabetes. Obesitas is geïdentificeerd als een van de belangrijkste risicofactoren voor NAFLD, een hoog-vet, hoog is sucrose-dieet (HFHS) de westerse stijl vetrijk dieet imiteert gebruikt om overgewicht bij de muis. Vervolgens kan de mate van leversteatose beoordeeld worden met verschillende methoden. Ten eerste, het lichaamsgewicht en lichaamssamenstelling analyse met kernspinresonantie (NMR) tonen de lipide-accumulatie tijdens voedertijd. Het vet en vetvrije massa kan worden gekwantificeerd in een niet-invasieve en real-time manier. Bovendien is magnetische resonantie beeldvorming (MRI) gebruikt om zowel het gehele lichaam en de lever verdeling van vet vertonen. De grijstinten signaal van de MRI-analyse kan worden omgezet een afbeelding leesbaar pseudo-kleur in, en de intensiteit van dede grijstinten en kleur is hemi-kwantificeerbare. Deze technologie biedt unieke voordelen voor het meten van de accumulatie van lipiden in levende dieren. Ten tweede, histologische analyse van de lever is de meest gebruikte methode om hepatische steatose bepalen. Hematoxyline en eosine (H &amp; E) kleuring geeft histologische, zoals hepatocyt morfologie en infiltratie van macrofagen, terwijl Oil Red O kleuring De maat en de positie van de vetdruppels in hepatocyten. Ten derde, het lipidegehalte analyse met chloroform / methanol extractie is een nauwkeurige en kwantitatieve meting van hepatische lipiden. Total triglyceride en cholesterol niveaus kunnen gemeten worden met biochemische methoden. Belangrijker vetextractie analyse en Oil Red O kleuring kan ook gebruikt worden in genetisch gemanipuleerde of farmaceutisch behandelde hepatocyten. Het voordeel van de onderhavige werkwijze is het gebruik van meerdere geoptimaliseerd benaderingen hepatische steatotic modellen genererenen volledig karakteriseren fenotypes zowel in vivo als in vitro. De DIO muismodellen kan recapituleren de pathologie en metabole fenotypen van humane leververvetting. Andere metabole parameters bij mensen kunnen worden gerepliceerd in dit model ook 8. Het genereren van de steatotic hepatocyte model vanwege de hoge glucose plus insuline, nuttig en overwint de beperkingen van kostbare en tijdrovende muiswerk. Tezamen zijn deze werkwijzen voldoende en essentieel voor de studie van hepatische dysfunctie lipide en insulineresistentie bij nutriënt overbelasting.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides kit</td><td>Fisher&nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Cholesterol kit</td><td>Fisher&nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I, Rat tail</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolve in PBS, 1 mM for stock</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6-well-plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>High fat high surcose diet (HFHS)</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerd analyse van<em&gt; in vivo</em&gt; en<em&gt; in vitro</em&gt; leversteatose

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Het opzetten van een systeem van procedures om in vivo en in vitro leververvetting kwalitatief en kwantitatief te karakteriseren, is belangrijk voor metabolisch onderzoek in de lever. Hier worden talrijke assays beschreven om het fenotype en de parameters van leververvetting in muis- en hepatocytenmodellen volledig te meten. 
Door fysiologische, histologische en biochemische methoden te combineren, kan dit systeem worden gebruikt om de progressie van leververvetting te beoordelen. In vivo geven de metingen van lichaamsgewicht en nucleaire magnetische resonantie (NMR) een algemeen begrip van muizen op een niet-invasieve manier. Hematoxyline en Eosine (H&E) en Oil Red O-kleuring bepalen de histologische morfologie en lipide-afzetting van leverweefsel onder omstandigheden van voedingsoverbelasting, zoals een vetrijk dieet. Vervolgens worden de totale lipidegehaltes geïsoleerd door extractie met chloroform/methanol, gevolgd door een biochemische analyse voor triglyceriden en cholesterol. Bovendien worden primaire muis-hepatocyten behandeld met hoge glucose plus insuline om lipide-ophoping te stimuleren, een efficiënt in vitro model om dieet-geïnduceerde hyperglycemie en hyperinsulinemie in vivo te imiteren. Daarna wordt de lipide-afzetting gemeten door Oil Red O-kleuring en chloroform/methanol extractie. Oil Red O-kleuring bepaalt intuïtieve leververvettingsfenotypen, terwijl de lipide-extractie-analyse de parameters bepaalt die statistisch geanalyseerd kunnen worden. De huidige protocollen zijn van belang voor wetenschappers op het gebied van leververvetting, insulineresistentie en type 2 diabetes.

Zoals getoond in Figuur 1A werd de muis lichaamsgewicht verhoogd tot 45 ± 1,2 g na 16 weken HFHS voeding, die ongeveer 1,5 maal hoger dan chow dieet voedingsgroep. De NMR lichaamssamenstelling analyses die de vetmassa en de vetvrije massa van muizen worden aangegeven (Figuur 1B). Het vet verdelingen van het gehele lichaam en de lever werden bepaald met MRI, en representatieve pseudo kleurenbeelden in levende, bewuste muizen worden getoond in Figu...

Hier worden geoptimaliseerde methoden beschreven om in vivo en in vitro modellen van hepatische steatose te genereren en om de steatotische fenotypes en gerelateerde fysiologische parameters te analyseren.

Geoptimaliseerd Analyse van<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Het algemene doel van deze procedure is om een geoptimaliseerde methode te bieden voor het genereren en karakteriseren van hepatische steatose met behulp van in vivo en in vitro benaderingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de mechanistische studie naar de hepatische dereplicatie van lipide- en glucosemetabolisme tijdens nutriëntenoverbelasting en obesitas. Een voordeel van deze technieken is dat het fysiologische verloop van hepatische steatose non-invasief kan worden beoordeeld voorafgaand aan histologische en biochemische analyse.Deze methode kan inzicht bieden in vetleverziekten. Ze kan ook worden toegepast op andere metabole ziekten, zoals insulineresistentie, diabetes type II en obesitas. De procedure zal worden gedemonstreerd door Zhimin, Yamei en Aoyuan.Het gaat hier om promovendi uit mijn laboratorium die onderzoek doen naar de transcriptionele regulatie van het lipide- en glucosemetabolisme. Neem, na het anesthetiseren van de donormuis, een bloedmonster via een hartpunctie en verzamel het bloed in een EDTA-buis. Om de lever te verwijderen, wordt het diafragma in de lengte van de lever doorgesneden en wordt de lever vervolgens voorzichtig uit

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In this video, we demonstrate in vitro staining of neutral lipids in hepatocytes to detect hepatic steatosis or excessive fat accumulation in liver. Excessive fat is accumulated in the cells in form of lipid droplets. Oil Red O is a lipid soluble dye that binds to intracellular neutral lipids in these lipid droplets. When observed under a light microscope, these intracellular lipid droplets appear intensely red in color.

Oil Red O Staining: A Technique for Staining Neutral Lipids in Hepatocytes for Detecting Hepatic Steatosis In Vitro

De novo lipogenese en β-vetzuuroxidatie vormen belangrijke metabole routes in hepatocyte, trajecten die zijn verstoord in verschillende metabole stoornissen, met inbegrip van vette lever ziekte. Hier laten we de isolatie van muizen primaire hepatocyten en beschrijven kwantificering van β-vetzuuroxidatie en lipogenese.

Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Het huidige rapport beschrijft een in vitro enzymatische test om fosfatidylethaanolaminmethyltransferase-activiteit te meten met behulp van Leishmania-celextracten. Deze test is gebaseerd op de overdracht van een radioactieve methylgroep van S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine naar endogeen fosfatidylethaanolamine.

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

In deze studie beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het induceren van lever vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen met het vetzuur zout natriumoleaat en gebruiken we methoden voor de detectie en kwantificering van lipide accumulatie, inclusief coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO'S) microscopie, cytofluorimetrische analyse, olie rood O kleuring, en qPCR.

Het induceren en karakteriseren van vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen

Dit protocol is bedoeld als een hulpmiddel om steatose en de moleculaire, biochemische, cellulaire veranderingen te bestuderen die worden veroorzaakt door de overblootstelling van hepatocyten aan lipiden in vitro.

Een model van experimentele steatose in vitro:hepatocytencelcultuur in lipide-overbelasting-geconditioneerd medium

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Met behulp van een dieet-geïnduceerde niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) muismodel, beschrijven we het gebruik van nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen, voornamelijk gericht op het hepatische vasculaire netwerk vanwege de significante betrokkenheid bij NAFLD-gerelateerde leverontregeling.

Nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken voor het beoordelen van de progressie van niet-alcoholische leververvetting

Hierin demonstreren we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503 fluorescentie-gebaseerd protocol voor lipidedruppelkarakterisering in leverweefsel. Door het gebruik van orthogonale projecties en 3D-reconstructies maakt de fluorofoor een succesvolle discriminatie tussen microvesiculaire en macrovesiculaire steatose mogelijk en kan het een complementaire benadering zijn van de klassieke histologische protocollen voor de beoordeling van leversteatose.

Analyse van fluorescerend gekleurde lipidedruppels met 3D-reconstructie voor hepatische steatosebeoordeling

Dit artikel beschrijft het gebruik van door oliezuur geïnduceerde HepG2-cellen als model voor metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte.

In vitro modellering van vetafzetting bij metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte

Een optisch systeem ontwikkeld lever microcirculatie visualiseren met FITC-gelabelde erythrocyten en de partiële zuurstofdruk in de microvaatjes meten laser-assisted phosphorimetry. Deze methode kan worden gebruikt om fysiologische en pathologische mechanismen onderzoeken te analyseren microvasculaire structuur diameter snelheid van de bloedstroom en zuurstofspanning.

Visualisatie en analyse van de bloedstroom en zuurstofverbruik in de lever microcirculatie: Toepassing op een acute hepatitis Model

Leer geoptimaliseerde methoden voor het genereren en karakteriseren van leversteatose met in vivo- en in vitro-benaderingen. Deze technieken bieden niet-invasieve beoordeling van metabole ziekten zoals vetleverziekte en diabetes type II.

Geoptimaliseerd Analyse van

Meer video's verkennen