Подготовка и оценка

Общая цель данной процедуры — получение тетразинов, меченных технецием-99m, для предварительно нацеленной визуализации с использованием биоортогональной химии с биомолекулами, модифицированными транс-циклооктеном, в качестве векторов нацеливания. Этот метод представляет собой важную новую платформу для разработки новых радиофармацевтических препаратов. Благодаря предварительному нацеливанию описанные здесь комплексы технеция могут быть использованы для визуализации широкого спектра органов, тканей и биомаркеров.

Данный метод является преимущественным, поскольку он представляет собой надежный пошаговый способ получения тетразинов, меченных технецием-99m, который является наиболее широко используемым медицинским изотопом в диагностической медицине. Эту методику можно применять с различными таргетными векторами, включая малые молекулы и антитела. Она также может быть использована для радиотерапии путем замены технеция на бета-излучающие изотопы рения.

Часть процедур на животных продемонстрирует Нэнси Джензен, техник по биологии в нашей лаборатории. Чтобы начать процедуру радиомаркировки, в микроволновом флаконе смешайте 8 mg боранокабоната калия, 15 mg карбоната натрия, 20 mg десятигидрата тетрабората натрия и 25 mg тетрагидрата тартрата калия-натрия. Продувайте флакон газом аргоном в течение 10 минут.

Затем добавьте во флакон 4 мл пертехнетата технеция-99m в 0,9% физиологическом растворе с активностью 1 110 МБк. Перенесите реакционную смесь в микроволновый реактор и перемешивайте в течение 10 секунд. Затем нагрейте смесь при температуре 110 °C в течение 3,5 минут для получения катиона триакватрикарбонилтехнеция-99m.

Добавьте около 400 µL 1 M соляной кислоты, чтобы довести pH раствора до 3,5–4. Затем для каждого тетразинового лиганда растворите 2 мг лиганда в 250 µL метанола. Добавьте 250 µL комплекса технеция-99m с активностью 74 MBq в каждый раствор лиганда.

Нагрейте смесь в микроволновом реакторе при 60 °C в течение 20 минут. Для тетразиновых лигандов с t-Butyl-защитными группами перенесите раствор из микроволновой виалы в сцинтилляционную виалу объемом 20 мл, затем выпарите растворитель и снова растворите каждый комплекс в 1 мл раствора дихлорметана и трифторуксусной кислоты в соотношении один к одному по объему. Затем перенесите раствор в микроволновую виалу и нагрейте эти комплексы в микроволновом реакторе при 60 °C в течение 6–10 минут для снятия защиты с лигандов.

Охладите комплексы до комнатной температуры, затем выпарите растворитель. Перед переходом к очистке методом ВЭЖХ растворите остатки в 500 µL водного раствора ацетонитрила или метанола с водой в соотношении один к одному. Для очистки каждого радиоактивно меченого комплекса тетразина используйте обращенно-фазовую ВЭЖХ на колонке C18 с градиентом элюции ацетонитрила и воды от 30% до 70%, затем до 40% и до 60% в течение 20 минут; при этом в элюенте на протяжении всего процесса должно присутствовать 0,1% трифторуксусной кислоты.

Соберите очищенный продукт, когда его вымывание будет видно на гамма-кривой. Затем проведите совместную инъекцию каждого меченого комплекса с раствором 0.125 milligrams соответствующего комплекса радия-тетразина в 20% methanol в воде. Сравните времена удерживания пика комплекса рения на УФ-кривой и пика комплекса технеция на гамма-кривой, чтобы подтвердить идентичность гамма-пика.

Удалите растворитель из каждого очищенного комплекса технеция-тетразина. Приведите каждый комплекс к концентрации 7.4 kBq/µL в фосфатно-солевом буферном растворе с 0.5% бычьего сывороточного альбумина и 0.01% полисорбата 80. Для каждой мыши наберите в шприц 100 µL раствора производного TCOPB в физиологическом растворе с концентрацией 5 µg/µL для подготовки дозы 20 mg/kg.

Присоедините иглу калибра 30G к дозирующему шприцу. Поместите мышь в устройство для физической фиксации. Найдите вены на латеральной поверхности хвоста примерно в двух сантиметрах от его конца и протрите эту область спиртовым тампоном.

Введите иглу шприца под малым углом параллельно вене. Медленно введите производное TCOBP. Извлеките иглу и прижмите к месту инъекции чистую марлевую салфетку, слегка надавливая до остановки кровотечения.

Через один час после инъекции производного TCOBP введите в хвостовую вену дозу желаемого комплекса технеция-99m с тетразином объемом 100 µL и активностью примерно 0,74 MBq. Используйте дозовый калибратор для измерения активности контрольного образца комплекса технеция объемом 100 µL непосредственно перед инъекцией. Сохраните контрольный образец для последующих измерений.

Наркотизируйте мышь смесью 3% isoflurane и 2% кислорода через шесть часов после инъекции. Положите мышь на спину, поместив нос в назальную маску для поддержания анестезии, и найдите мечевидный отросток. Подсоедините иглу 25-го калибра к шприцу, предварительно обработанному гепарином.

Введите иглу под углом 20 градусов под мечевидный отросток, немного левее срединной линии. После полного введения иглы медленно потяните поршень на себя, чтобы проверить наличие крови в ступице иглы, подтверждая успешную пункцию сердца. При необходимости скорректируйте положение иглы.

После прокола сердца медленно наберите в шприц один миллилитр крови. Перенесите образец крови в предварительно взвешенную пробирку для подсчета. Эвтаназируйте мышь путем перелома шейного отдела позвоночника, пока она находится под воздействием анестезии.

Поместите эвтаназированное животное в пластиковый пакет и измерьте активность всего тела с помощью калибратора доз. Затем извлеките кости коленного и плечевого суставов, желчный пузырь, почки, печень, щитовидную железу и трахею, а также хвост. Вместе с их содержимым извлеките желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник и слепую кишку, а также мочевой пузырь.

Промойте все собранные ткани, за исключением желчного пузыря и мочевого пузыря, в фосфатно-солевом буферном растворе для удаления крови. Промокните ткани насухо и поместите каждую из них в предварительно взвешенную пробирку для подсчета. Измерьте остаточную активность тушки.

Взвесьте каждый образец ткани и вычислите массу только самой ткани. Используйте многодетекторный гамма-счетчик для измерения активности пятимикролитровой аликвоты исследуемого образца комплекса технеция. Используя полученное значение в расчетах импульсов в минуту и активность, измеренную в момент инъекции, рассчитайте коэффициент пересчета.

Измерьте активность каждого образца ткани и жидкости с помощью гамма-детектора. Переведите значения в микрокюри и нормализуйте каждое значение по весу органа, чтобы определить процент введенной дозы на грамм ткани. Повторите этот процесс с дополнительными мышами без инъекции производного TCOPB в качестве серии отрицательного контроля.

С помощью данного метода было проведено мечение технецием-99m пяти комплексов тетразина, различающихся комбинациями линкера и ключевого лидера. Производное TCOPB, которое локализуется в областях костной ткани с высоким обменом кальция, использовалось для предварительного таргетирования плечевых и коленных суставов мышей. Для каждого соединения тетразина были рассчитаны соотношения процента введенной дозы на грамм ткани в костях и крови.

Все пять соединений быстро выводились из крови и накапливались в костной ткани, что указывает на протекание селективной биоортогональной реакции сочетания между тетразиновыми соединениями и производным TCOBP in vivo. Соединение три продемонстрировало наилучшее сочетание адресности и скорости выведения из крови. Эксперименты с отрицательным контролем показали, что радиоактивно меченные тетразиновые комплексы не локализовались в костной ткани значимо при отсутствии производного TCOBP.

Например, при отсутствии введения производного TCOBP соединение два обнаруживалось в высоких концентрациях в желчном пузыре и кишечнике, но в очень малых количествах в кости. У мышей, получавших производное TCOBP, наблюдалась значительная вариативность локализации в тканях среди пяти протестированных соединений. Так, по сравнению с другими комплексами, соединение три обнаруживалось в очень малых количествах в толстой кишке, печени, моче и мочевом пузыре, тогда как в кости его содержание было значительно выше.

При должном навыке описанный здесь метод мечения может быть выполнен полностью менее чем за два часа. При применении данной методики важно обеспечить точное взвешивание всех реагентов и продувку солей аргоном перед их добавлением в раствор технеция. Также критически важно довести pH раствора технеция до значения от 3,5 до 4 перед добавлением тетразинового лиганда.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготавливать и очищать тетразины, меченные технецием, и как они могут быть использованы для создания новых радиофармацевтических препаратов с помощью претаргетинга и биоортогональной химии. Не забудьте принять соответствующие меры предосторожности при работе с радиоактивными веществами, такие как изучение типа излучаемого излучения, а также оптимальных способов экранирования и обращения с образцами.