Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen der Stimulation des Kerbsignals an verschiedenen Stellen während des Osteoklastendifferenzierungsprozesses zu beobachten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, wie z.B.: Wie verändert sich die Rolle der Kerbsignalgebung während eines zellulären Prozesses? Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Marginalität, die es ermöglicht, sie an andere Zellen oder Kerbliganden anzupassen.

Während diese Methode Einblicke in die Osteoklastendifferenzierung geben kann, kann sie auch auf andere Prozesse wie das Zellüberleben, die Proliferation oder die Differenzierung anderer Zelltypen angewendet werden. Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie eine Maus in Rückenlage fixieren und die Haut mit 70 Prozent Ethanol desinfizieren. Machen Sie als Nächstes einen Schnitt entlang der vorderen Oberfläche einer hinteren Extremität, um die Tibia und den Femur freizulegen.

Gefolgt von einem Schnitt durch das Kniegelenk, um das distale Ende des Femurs zu befreien. Entferne den Oberschenkelknochen, indem du das Ende des Knochens in der Nähe des Beckens durchschneidest und das anhaftende Weichgewebe entfernst. Schneiden Sie durch den Knöchel, um das Schienbein und das Weichgewebe zu entfernen.

Halten Sie dann den Beinknochen mit einer Pinzette über ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und führen Sie eine 25- und Fünf-Achtel-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, in das ungeschnittene Ende des Knochens ein, um zwei Komma fünf Milliliter Alpha-MEM bei Raumtemperatur durch das abgeschnittene Ende des Knochens in das Röhrchen zu spülen. Wenn das gesamte Knochenmark entfernt wurde, nimmt der Knochen eine klare, beige Farbe an. Nachdem Sie das Knochenmark aus jedem Knochen entnommen haben, lassen Sie alle großen Ablagerungen am Boden des Röhrchens absetzen und übertragen Sie die trümmerfreie, knochenmarkzelle, die den Überstand enthält, in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.

Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Dann lysieren Sie die roten Blutkörperchen in nullkomma fünf Millilitern ACK Lysis Puffer bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Am Ende der Inkubation stellen Sie die Isotonie mit 10 Millilitern PBS wieder her und sammeln die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern frischem Alpha MEM zum Plattieren. In der mit 100 Millilitern Gewebekultur behandelten Schale, promouse. Und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator.

Nach der Anreicherung für die Osteoklastenvorläufer waschen Sie die Zellen in fünf Millilitern PBS und behandeln Sie sie drei bis fünf Minuten lang mit einem Milliliter Zelldissoziationsreagenz bei Raumtemperatur, bis die Osteoklastenvorläufer durch sanftes Klopfen entfernt werden können. Geben Sie dann vier Milliliter Alpha MEM in die Schale und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nach der Zählung verdünnen Sie die Vorläufer auf eine fünfmal 10 bis vierte Zellen pro Milliliter Konzentration in Alpha MEM.

Behandeln Sie sie mit MCSF und RANKL und säen Sie dann sofort einen Milliliter Zellen in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebeplatte. Weitere Inkubation und 37 Grad Celsius im befeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Ersetzen Sie nach zwei Tagen das Medium durch einen Milliliter frisches Osteoklastenmedium, um die Differenzierung fortzusetzen.

Für eine kontinuierliche Simulation der Kerbsignalisierung beschichten Sie eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 250 Mikrolitern Ziegen-Anti-Human-IGG-FC-Antikörper in PBS. Entfernen Sie nach einer Stunde bei Raumtemperatur alle ungebundenen Antikörper mit drei Wäschen und einem Milliliter PBS. Geben Sie als Nächstes das Fusionsprotein jagged1-FC in PBS für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur in die Vertiefung.

Waschen Sie die Vertiefung am Ende der Inkubation dreimal mit frischem PBS, wie gerade gezeigt. Nach der dritten Wäsche entfernen Sie das PBS und plättieren sofort zwei Komma sechs mal 10 bis zum vierten Osteoklastenvorläufer pro Quadratzentimeter auf die beschichtete Oberfläche. Anschließend wird die Platte in den Gewebekultur-Inkubator überführt, um eine kontinuierliche Kerbsignalisierung für bis zu drei Tage zu ermöglichen.

Für eine vorübergehende Stimulation der Notch-Signalgebung fügen Sie zunächst ein Mikrogramm jagged1-FC mit 40 Mikrolitern Protein G-Agarose-Kügelchen in einem Punkt und fünf Milliliter PBS für eine zweistündige Inkubation mit Rotation bei vier Grad Celsius hinzu. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Kügelchen durch Zentrifugation, gefolgt von zwei Waschgängen und einem Punkt fünf Millilitern PBS unter denselben Zentrifugenbedingungen. Nach dem zweiten Waschen werden die gezackten1 konjugierten Kügelchen in 130 Mikrolitern pro Quadratzentimeter Nährmedium erneut suspendiert und das gesamte Volumen der Kügelchen direkt auf zwei Komma sechs mal 10 zu den vierten Osteoklastenvorläufern in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte für ihre Kaltkultur bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid gegeben.

Entfernen Sie die Kügelchen nach der entsprechenden experimentellen Stimulationsphase mit mehreren Waschgängen PBS. Die Aktivierung des Notch-Signalwegs kann dann durch Messung der Transkription des Zielgens getestet werden. Bei richtiger Kultivierung weisen Osteoklastenvorläufer eine primär längliche, spindelförmige Morphologie mit einem glatten Zytoplasma auf.

Bei der Aktivierung breiten sich die Vorläufer aus und werden mit schaumigem Zytoplasma abgeflacht, wodurch eine Resistenz gegen den RANK-Signalweg entsteht und sie nicht effizient zu reifen Osteoklasten differenzieren. Unter den richtigen Kultur- und Differenzierungsbedingungen differenzieren angereicherte Osteoklastenvorläufer und infundieren innerhalb von drei Tagen nach der Behandlung zu großen, TRAP-positiven, multinukleären Osteoklasten. Das Aussäen von Osteoklasten-Vorläufern auf gezackte1 FC-beschichtete Oberflächen für deren kontinuierliche Stimulation induziert innerhalb von 24 Stunden die obere Regulation der Expression spezifischer Notch-Zielgene, während die Expression anderer Notch-Zielgene durch die Stimulation nicht signifikant verändert wird.

Die vorübergehende Stimulation des Notch-Signalwegs über jagged1 FC-beschichtete Kügelchen mit nur 600 Nanogramm des jagged1 FC-Proteins induziert ebenfalls eine signifikante Erhöhung der Expression der spezifischen Notch-Zielgene. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine häufige Ursache für das Versagen der Differenzierung von Osteoklastenvorläufern die versehentliche Aktivierung während der Handhabung ist. Dies kann durch die Messung spezifischer Aktivierungsmarker wie TNF bis Inos beurteilt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man Osteoklastenvorläufer unterscheidet und auch die Kerbsignalisierung sowohl vorübergehend als auch kontinuierlich stimuliert.