Name: Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Stimulation des Notch-Signalwegs in Maus-Osteoklasten-Vorläufern zur Untersuchung der Zellulären Differenzierung. Diese Methode liefert Einblicke in die Osteoklastogenese und ist auf andere Zelltypen übertragbar.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), ein Stipendium der AO Foundation (S-16-12A), das Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center und einen intramuralen Forschungsentwicklungsfonds für orthopädische Chirurgie. JWA wird durch das PENN-PORT-Stipendium der University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) unterstützt, das vom National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08) finanziert wird.

Alle Forschung Wirbeltiere wurde in Übereinstimmung mit Protokollen, die von der University of Pennsylvania Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt. 1. Kultur Nährmedienzubereitung <ol><li> Bereiten α-MEM mit Minimum Essential Medium (MEM) -Pulver und 1,9 g Natriumbicarbonat in 900 ml H 2 O und ergänzt mit 2 mM L-Glutamin Auflösen, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 ml hitze- inaktiviertes fötales Rinderserum. Sterilisieren einen 0,22 um Polyethersulfon (PES) Filter. </li><li> Bereiten Sie Makrophagen-Medium durch Ergänzung α-MEM mit 35 ng / ml rekombinantem Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) </li><li> Bereiten Sie Osteoklasten Medium durch Ergänzung Makrophagen-Medium mit 100 ng / ml RANKL </li></ol> 2. Knochenmarkzellisolierung <ol><li> Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 25⅝-Gauge-Nadel pro Maus mit 10 ml α-MEM. </li&gt; <li> Euthanize Mäuse über 10 min Einwirkung von CO 2 bei einer Flussrate von 1,3 L / min. Stellen Sie sicher , Tier Tod durch folgende CO 2 Exposition mit Genickbruch vor mit Dissektion fortfahren. </li><li> Mit sauberer Technik, sezieren und trennen die Tibiae und femora. Desinfizieren der Haut von Mäusen mit 70% Ethanol , bevor ein Einschnitt entlang der anterioren Oberfläche jedes Hinterbein machen Tibia und Femur zu belichten. <ol><li> Schnitt durch das Kniegelenk, das distale Ende des Femurs freizugeben, und durch den Femur so nahe am Becken wie möglich schneiden. Entfernen Sie den Oberschenkelknochen und reinigen so viel Weichgewebe wie möglich. die Tibia, schneiden durch den Knöchel und entfernen Sie so viel Weichgewebe wie möglich zu entfernen. </li></ol></li><li> Halten Sie die Knochen mit einer Pinzette und bündig Mark in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 2,5 ml Raumtemperatur α-MEM Kombination Markwallungen aus einer einzigen Maus in einem einzigen Rohr. HINWEIS: Eine erfolgreiche Mark Flush wird die Färbung von t änderner Knochen von rot bis beige. </li><li> Lassen Sie Trümmer auf den Boden der Röhre und Überstand in ein sauberes 15 ml konischen Röhrchen kümmert absetzen zu vermeiden, alle Ablagerungen zu übertragen. HINWEIS: Einige Zellen können auch mit dem Mark Trümmer absetzen. Wenn eine größere Anzahl von Zellen erforderlich ist, marrow Wallungen kann durch einen 70 &amp; mgr; m Zellsieb in ein sauberes 15-ml-Röhrchen gefiltert werden. </li><li> Zentrifugenröhrchen (s) bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur Zellen zu pelletieren. </li><li> Vakuum ansaugen den Überstand und resuspendiere Zellpellet in 0,5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer und Inkubation bei 37 ° C für 3 min roten Blutkörperchen zu lysieren. </li><li> 10 ml PBS, um direkt ACK-Zelllösung und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min. HINWEIS: Die bisher roten Zellpellet sollte nun beige sein. </li><li> Vakuum absaugen Überstand und Pellet in 10 ml α-MEM, und die Platte in einer 100-mm-Gewebekultur-behandelte Schale. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchtetenGewebekultur-Inkubator. HINWEIS: Zählung der Zellen für diesen Schritt nicht erforderlich ist. Während dieser Zeit werden adhärente Zellen aus dem Knochenmark in die Kulturoberfläche befestigen; nicht-adhärenten Zellpopulationen Knochenmark wird in der Schwebe bleiben. MCSF ist in dem Kulturmedium während dieser anfänglichen Inkubation nicht vorhanden. </li></ol> 3. Anreicherung von Osteoklasten Precursors <ol><li> Nach Inkubation über Nacht von marrow Wallungen, Transferkulturüberstand, die nicht-adhärenten Zellen in eine 50 ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Die Kulturschalen mit anhaftenden Zellen, die Knochenmark mesenchymale Vorläuferzellen umfassen, können mit frischen α-MEM verworfen oder eingespeist werden, wenn für andere Experimente gewünscht. HINWEIS: Osteoklasten können sie in Gewebekultur-behandelten Schalen bei einer Dichte von 4 x 10 5 Zellen / cm 2 in Osteoklasten - Medium und erfrischende Medium jeden zweiten Tag für 5 Tage durch direkt aus diesen nicht-adhärenten Knochenmarkzellen differenziert werden Plattieren. </li&gt; <li> Fügen α-MEM nicht-adhärenten Zelllösung auf ein Endvolumen von 18 ml und füge M-CSF bis zu einer Endkonzentration von 35 ng / ml. </li><li> 3 ml Zellsuspension jeder bis 6 60 mm Federung Kulturschalen. </li><li> Inkubieren Platten über Nacht bei 37 ° C in einer angefeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Während dieser Zeit wird M-CSF stimuliert die Differenzierung von Makrophagen, die auch auf nicht-Gewebekultur-behandelten Oberflächen anhaften kann. </li><li> Nach über Nacht wieder Futter Osteoklastenvorläufer mit 3 ml frischen Makrophagen-Medium inkubiert. Dies entfernt nicht-adhärente Zellen, die nicht zu Makrophagen differenziert haben. </li><li> Weiter zur Kultur Osteoklastenvorläufer bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 Tage oder bis Kulturen erreichen rund 70% Konfluenz. </li></ol> 4. Differenzierung von Osteoklasten <ol><li> Osteoklasten-Vorläufer mit 5 ml PBS waschen und behandeln Zellen mit 1 ml marinen Ursprungs proteolytischen / kollagenolytischer Enzym bei Raumtemperatur bis zum cells kann durch leichtes Klopfen der Platte abgelöst werden. HINWEIS: Osteoklasten-Vorläufer kann nur aufgehoben werden, wenn sie in der Schwebe Geschirr kultiviert werden; Vorläufern befestigen zu fest auf Gewebekultur-behandelten Oberflächen angehoben werden. Trypsin kann Osteoklastenvorläufer aktivieren und sollte vermieden werden. </li><li> 4 ml α-MEM zu jeder Schale und Transfer Zellen einem 50 ml konischen Röhrchen. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnter Zellen zu einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / ml und füge M-CSF bis zu einer Endkonzentration von 35 ng / ml und RANKL zu einer Endkonzentration von 100 ng / ml. </li><li> Samenzellen in einer Dichte von 2,6 x 10 4 Zellen / cm 2 in Gewebekultur-behandelten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einer angefeuchteten Gewebekultur - Inkubator für 2 Tage. Differentiation wird typischerweise in 24-Well - Platten durchgeführt, wobei 5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung ausgesät. </li><li> 2 Tage nach dem Beginn der Differenzierung, Wiederfutterzellen durch Medium mit 1 ml frischem osteoc ersetzenletzte Medium. HINWEIS: die Differenzierung von Osteoklasten wird in der Regel innerhalb von 3 Tagen abgeschlossen sein. Resultierende Osteoklasten können TRAP-gefärbt für die einfache Quantifizierung und morphologische Analyse sein. </li></ol> 5. Kontinuierliche Stimulation der Notch-Signalweg mit Jagged1 beschichteten Oberfläche <ol><li> Suspend-Ziege-Anti-Human-IgG Fc-Antikörper in PBS bei einer Konzentration von 10 ug / ml (1: 1000-Verdünnung von 10 mg / ml stock). Hinzufügen Antikörperlösung zu Kulturoberfläche mit einer Dichte von 1,3 &amp; mgr; g / cm 2 und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Im Fall von 24-Well-Platten, fügen 250 ul (2,5 ug) pro Vertiefung. </li><li> Vakuum absaugen Brunnen und füllen mit 1 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal. </li><li> Suspend rekombinantes Jagged1-Fc-Fusionsprotein in PBS bei einer Konzentration von 10 ug / ml. Hinzufügen Jagged1-FC - Lösung auf den Antikörper-beschichteten Kulturoberfläche mit einer Dichte von 1,3 &amp; mgr; g / cm 2 und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur. Kulturflächen mit einem Antikörper beschichtet only können als Kontrollen verwendet werden. </li><li> Vakuum absaugen Brunnen und füllen mit 1 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal. Halten PBS in Vertiefungen bis unmittelbar vor der Aussaat zu Zelle sie vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Seed 2,6 x 10 4 Osteoklastenvorläufer / cm 2 auf beschichteten Oberflächen. Notch-Signalweg wird kontinuierlich für mindestens 3 Tage stimuliert. </li></ol> 6. Temporäre Stimulation der Notch-Signalweg mit Jagged1 beschichteten Beads <ol><li> Kombinieren der folgenden in einem entsprechend dimensionierten Schlauch: 0,5 &amp; mgr; g / cm 2 Jagged1-Fc, 21 &amp; mgr; l / cm 2 Protein G - Agarose - Perlen, und PBS auf ein Endvolumen von 1,5 ml. eine ausreichende Anzahl von Jagged1 Perlen für 1 Well einer 24-Well-Platte, kombinieren 1 ug Jagged1-Fc, 40 ul Protein G Agarose-Kügelchen, und PBS auf 1,5 ml zu bereiten. </li><li> Inkubieren Rohr mit Rotation bei 4 ° C für 2 Stunden. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 1 min bis Pellet-Perlen. Resuspendieren Perlen in 1,5 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Wasch2 weitere Male. </li><li> Resuspendieren Jagged1 Perlen in 130 &amp; mgr; l / cm 2 Kulturmedium und gelten für kultivierten Zellen. </li><li> Inkubieren Zellen mit Perlen bei 37 ° C und 5% CO 2 für die gewünschte Zeit. Entfernen Perlen mit mehreren Wäschen von PBS oder Kulturmedium. </li><li> Stellen Sie sicher , Notch - Signalaktivierung über die Messung von Notch Zielgen Transkripte 10. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls Kultur und in vitro Differenzierung von Osteoklasten - Vorläufer liefert eine nützliche Plattform für die Untersuchung von molekularen Mechanismen der osteoclastogenesis und Identifizierung von therapeutischen Ziele für die Knochenregeneration und die Erhaltung der Knochenmasse. Wenn Maus Osteoklastenvorläufer Kultivierung ist das wichtigste Element Wartung von Vorläufern in einem naiven Zustand. Als Makrophagen-ähnliche Zellen werden Osteokl...

Die Säuger Notch - Signalwegs ist homolog zu den gleichen Stoffwechselweg in Drosophila melanogaster und besteht aus vier transmembranen Notch - Rezeptoren (Notch1-4) und fünf membrangebundenen Liganden der Jagged (JAG1 &amp; JAG2) und Delta-like (DLL1, 3, &amp; 4) Familien 1. Notch - Signal wird eingeleitet , wenn Notch - Rezeptor auf einer Empfangszelle , die durch Liganden auf einer Sendezelle 2 gebunden ist. Während dieser trans-Aktivierung, die membrangebundene erzeugt Notch - Liganden eine Streckkraft auf die Membran-gebundenen Notch - Rezeptor 3, 4. Die Dehnkraft der Ligandenbindung induziert Konformationsänderungen in dem Notch-Rezeptor, der von TNFalpha umwandelndes Enzym (TACE) extrazelluläre Spaltung des Rezeptors erleichtern durch ein intrazelluläres Spaltungsereignis von einem Presenilin-enthaltenden gamma-Sekretase-Komplex (γ-Sekretase) vermittelt gefolgt. γ-Sekretase gibt den Notch intracellular Domain (NICD), die in den Zellkern transloziert, wo es eine Transkriptionsaktivierungskomplex bildet mit CBF-1-Su (H) -LAG-1 (CSL), Mastermind-like (MAML) und zelltypspezifische Faktoren die Expression anzutreiben von Zielgenen 5. Die mechanischen Elemente des Notch - Signalaktivierung Ergebnis in der Notwendigkeit für einzigartige Verfahren der Notch - Signalweg - Aktivierung in vitro. Soluble Notch-Liganden binden an Rezeptoren Notch, aber nicht Dehnungskräfte zu erzeugen, die notwendig für die Freigabe NICD während zugleich kompetitiv die Bindung von zellassoziierte Liganden Notch hemmen. Somit Zugabe von löslichem Notch - Liganden an Kulturmedium können normale Notch dämpfen 6 Signalgebung, 7. Glücklicherweise Notch - Liganden können NICD Freisetzung induzieren , wenn sie 5 zu einem geeigneten starren Substrat befestigt sind, 8, 9,10. Aussäen Zellen auf Liganden-beschichteten Kultursubstrate oder Aufbringen Ligand-beschichteten Kügelchen an Zellen kann sowohl aktivieren Notch-Signalisierung, und die Wahl zwischen ihnen hängt in erster Linie von dem gewünschten Zeitpunkt der Notch-Stimulation. Für sofortige temporäre Notch-Signalaktivierung, wie während der Mittelpunkt einer funktionellen oder Differenzierungsassay, Notch-Liganden an Agarose beads können, zu kultivierten Zellen angewendet würde erwünscht sein, werden gebunden und gewaschen jederzeit aus. Für länger anhalt Notch-Signalisierung von Beginn einer Kulturperiode, Gewebekulturplatten können vor dem Aussähen der Zellen mit dem Liganden überzogen werden. Für die Zwecke dieses Protokolls werden Verfahren durchgeführt Maus Osteoklastenvorläufer verwenden, aber die Verfahren und Variationen der hier beschriebenen Verfahren sind anwendbar auf eine große Vielzahl von Zelltypen 6, 11, 12, 13, </sup&gt; 14. Osteoklasten sind terminal differenzierten hämatopoetischen linage Zellen , die für die Resorption von Knochengewebe verantwortlich sind, und sie sind in mehreren Erkrankungen des Knochenschwundes 15 gebracht. Somit ist in vitro Untersuchung der Differenzierung von Osteoklasten aus ihren Monocyten / Makrophagen-Abstammungslinie Vorstufen und die molekularen Mechanismen , die Kontrolle ihrer Funktion zu einem besseren Verständnis der Osteoklasten und Entwicklung neuer Knochenregenerierungs Therapien wesentlich ist. Während es nun , dass Notch - Signalweg spielt eine positive Rolle bei der Differenzierung und Funktion von Osteoklasten, Variationen sowohl in der Notch - Signal Stimulation und Osteoklasten - Vorläuferkultur und Differenzierung allgemein akzeptiert wird geführt zunächst widersprüchlichen Ergebnisse 16, 17, 18, 19. Näherer Betrachtung der Unterschiede in den Verfahren und der Verwendung von genetischenModelle haben stark die Rolle der Notch - Signalweg in osteoclastogenesis geklärt, aber Anwendung standardisierter Notch Stimulation und Kulturmethoden könnten solche Kontroversen in zukünftigen Studien der Notch - Signalweg in anderen Zelltypen 20, 21, 22, 23 zu verhindern. Es gibt mehrere Methoden zum Züchten und Maus Osteoklastenvorläufer Differenzierung und, wie mit unterschiedlichen Methoden zur Stimulierung von Notch-Signalisierung, die beste Methode hängt von der Versuchs Frage abhängen. Hier unsere bevorzugte Methode zur Kultivierung von adhärenten und nicht adhärenten Fraktionen von Mark aus Maus langen Knochen gespült Zellen präsentiert werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, erfordern im wesentlichen keine Spezialausrüstung und Herstellung von Zellen, die zu einer Vielzahl von Differenzierungsmethoden anwendbar sind.

<table><tbody><tr><td>Rekombinante Maus M-CSF</td><td>Biolegend</td><td>576402</td><td>Von mehreren Lieferanten erhältlich, Testaktivität vor Experimenten</td></tr><tr><td>Rekombinante Maus RANKL</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>200-04</td><td>Von mehreren Lieferanten erhältlich, Testaktivität vor Experimenten</td></tr><tr><td>Rekombinante humane Jagged1-Fc</td><td>R& D Systems</td><td>1277-JG-050</td><td>Von mehreren Lieferanten erhältlich, Testaktivität vor Experimenten</td></tr><tr><td>Protein G Agarosekügelchen</td><td>InvivoGen</td><td>gel-agg-2</td><td></td></tr><tr><td>Ziege anti-human IgG Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-001-008</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für die Accutase-Zelldissoziation</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Wird zum Heben von Osteoklastenvorläufern</td></tr><tr><td>verwendet Saure Phosphatase, Leukozyten (TRAP) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td>Wird verwendet, um differenzierte Osteoklasten zu färben</td></tr></tbody></table>

die stimulation der notch-signalweg in maus-osteoklasten precursors

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch-Signalübertragung ist eine Schlüsselkomponente mehrerer physiologischer und pathologischer Prozesse. Die Art des Notch-Signalwegs macht jedoch die In-vitro-Untersuchung seiner unterschiedlichen und manchmal widersprüchlichen Rollen zu einer Herausforderung. Als Bestandteil der direkten Zell-Zell-Kommunikation sowohl mit Rezeptoren als auch mit Liganden, die an die Plasmamembran gebunden sind, kann der Notch-Signalweg in vitro nicht durch einfache Zugabe von Liganden zu Kulturmedien aktiviert werden, wie es bei vielen anderen Signalwegen möglich ist. Stattdessen müssen Notch-Liganden den Zellen in einem immobilisierten Zustand präsentiert werden. 
Variationen in den Methoden der Aktivierung des Notch-Signalwegs können in kultivierten Zellen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Insbesondere bei Osteoklastenvorläufern haben Unterschiede in den Methoden der Notch-Stimulation und der Kultur und Differenzierung von Osteoklastenvorläufern zu Uneinigkeit darüber geführt, ob der Notch-Signalweg ein positiver oder negativer Regulator der Osteoklastendifferenzierung ist. Während nähere Vergleiche der Osteoklastendifferenzierung unter verschiedenen Notch-Stimulationsbedingungen in vitro und genetische Modelle die Kontroverse um den Notch-Signalweg und Osteoklasten weitgehend beigelegt haben, könnten standardisierte Methoden zur kontinuierlichen und temporären Stimulation des Notch-Signalwegs in kultivierten Zellen solche Diskrepanzen in Zukunft verhindern.
Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Stimulierung des Notch-Signalwegs speziell in kultivierten Maus-Osteoklasten-Vorläufern, obwohl diese Methoden mit geringfügigen Anpassungen auf jeden adhärenten Zelltyp anwendbar sein sollten. Die erste Methode erzeugt eine kontinuierliche Stimulation der Notch-Signalgebung und beinhaltet die Immobilisierung des Notch-Liganden auf einer Gewebekulturoberfläche vor der Aussaat der Zellen. Die zweite, bei der ein Notch-Ligand verwendet wird, der an Agarosekügelchen gebunden ist, ermöglicht eine vorübergehende Stimulation der Notch-Signalgebung in Zellen, die bereits an einer Kulturoberfläche haften. Dieses Protokoll umfasst auch Methoden zum Nachweis der Notch-Aktivierung in Osteoklasten-Vorläufern sowie repräsentative transkriptionelle Marker für die Aktivierung des Notch-Signalwegs.

Das Ziel dieser Methode ist es, Kultur und Notch-Signalweg in Osteoklasten-Vorläufer zu stimulieren. Wenn sie richtig kultiviert weisen Osteoklastenvorläufer eine hauptsächlich längliche spindelförmige Morphologie mit glatten Zytoplasma (1A). Sorgfalt sollte immunologische Aktivierung der Osteoklastenvorläufer zu vermeiden. Nach der Aktivierung aus und werden dabei Vorstufen mit schaumigen Zytoplasma abgeflacht (1B). Diese &quot;Spiegelei&quot; Zellen si...

Notch-Signalisierung ist eine Form der zellulären Kommunikation, die auf direktem Kontakt zwischen Zellen beruht. Um den Notch-Signalweg in vitro korrekt zu induzieren, müssen Notch-Liganden den Zellen in einem immobilisierten Zustand präsentiert werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur in vitro Stimulation des Notch-Signalwegs in Maus-Osteoklasten-Vorläufern.

Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen einer Notch-Signalwegsaktivierung zu verschiedenen Zeitpunkten während des Osteoklastendifferenzierungsprozesses zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise: Wie verändert sich die Rolle der Notch-Signalübertragung während eines zellulären Prozesses? Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Flexibilität, die es ermöglicht, sie an andere Zelltypen oder Notch-Liganden anzupassen.Obwohl diese Methode Einblicke in die Osteoklastendifferenzierung ermöglicht, kann sie auch auf andere Prozesse wie Zellüberleben, Proliferation oder die Differenzierung anderer Zelltypen angewendet werden. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine Maus in Rückenlage fixieren und die Haut mit 70 Prozentigem Ethanol desinfizieren. Anschließend führen Sie einen Schnitt entlang der vorderen Fläche eines Hinterbeins durch, um Tibia und Femur freizulegen.Anschließend erfolgt ein Schnitt durch das Kniegelenk, um das distale Ende des Femurs freizulegen. Entfernen Sie den Femur, indem Sie nahe dem Becken durch das Knochenende schneiden, und entfernen Sie sämtliches a

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

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