Name: Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 배우세요 SPLASH 방법을 사용하여 생체 내 RNA-RRNA 상호작용을 게놈 전체적으로 매핑하는 기술을. 효모, 박테리아, 인간 세포 등 다양한 생물체에 적용 가능한 고효율 RNA 상호작용 분석법입니다.

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Wan 연구원과 Nagarajan 연구원에게 유익한 토론에 감사드립니다. N.Nagarajan은 A * STAR의 자금 지원을받습니다. Y.Wan은 A * STAR 및 Society in Science-Branco Weiss Fellowship의 지원을받습니다.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

여기서 우리는 게놈 전체에서 pair-wise RNA 상호 작용을 확인하는 방법 인 SPLASH의 실험 및 계산 워크 플로우에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 박테리아, 효모 및 인간 문화에서 SPLASH를 성공적으로 활용했으며 전략이 다양한 세포 상태에서 다양한 유기체에 광범위하게 적용될 수있을 것으로 기대합니다. 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 하류 공정에 적합한 물질을 가지기 위해 적어도 20 μg의 가교 결합 된 RNA로 시작하는 것입니다. 그런 다음 RNA를 100 염기로 단편화하고 PAGE 크기로 선택합니다. 이러한 단계는 라이브러리 생성 과정에서 단량체가 아닌 결찰 된 키메라를 우선적으로 풍부하게하는 데 중요합니다. 우리는 일반적으로 조각과 첫 번째 크기 선택 후 RNA 약 1.5 μg을 복구하고 RNA는 SPLASH 워크 플로우에 따라 cDNA 라이브러리로 변환됩니다. 우리는 시작 RNA 의이 금액은 우리가 h에 대한 충분한 자료를 생성 할 수 있습니다PCR 증폭의 15주기 미만을 사용하여 처리량 시퀀싱. 증가...

거대 분자들이 서로 어떻게 접히고 상호 작용하는지 연구하는 것은 세포에서의 유전자 조절을 이해하는 열쇠입니다. 지난 수십 년간 DNA와 단백질이 유전자 조절에 어떻게 기여하는지에 대한 많은 노력이 집중되어 왔지만, 유전자 발현의 전사 후 조절에 관해서는 알려진 바가 상대적으로 적다. RNA는 선형 서열과 2 차 및 3 차 구조 모두에서 정보를 전달한다. 생체 내에서 자신과 다른 사람과 쌍을 이루는 능력이 중요합니다. 고 처리량 RNA 2 차 구조 탐색에서의 최근의 진보는 트랜스 크립 풋 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howe에서 이중 및 단일 가닥 영역의 위치에 대한 가치있는 통찰을 제공했다페어링 상호 작용 파트너에 대한 ver 정보가 아직 많이 누락되었습니다. transcriptome에서 어떤 RNA 서열이 다른 RNA 영역과 상호 작용 하는지를 결정하기 위해, 우리는 전구 쌍방향 정보가 필요합니다. 쌍방향의 RNA 상호 작용을 전지구하고 공평하지 않은 방식으로 매핑하는 것은 전통적으로 중요한 과제였습니다. CLASH 9 , hiCLIP 10 및 RAP 11 과 같은 이전의 접근법은 대규모 방식으로 RNA 상호 작용을 확인하는 데 사용되지만 이러한 기술은 일반적으로 특정 단백질 또는 RNA 종과 상호 작용하는 RNA의 하위 집합에 대해 RNA 염기쌍을 매핑합니다. 세계적 RNA 상호 작용을 연구하는 최근의 연구에는 생체 내에서 RNA 상호 작용 을 안정화시키지 않는 생체 내 상호 작용의 부분 집합 만 포착 할 수있는 RPL 12 방법이 포함된다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 우리와 다른 사람들은 게놈 전반에 걸친 공평한 전략을 개발하여p RNA interactomes 를 in vivo 에서 사용하여 crosslinker psoralen 13 , 14 , 15 의 변형 된 버전을 사용했습니다. 이 프로토콜에서는 생체 내에서 염기쌍 결합 RNA를 가교 결합시킨 비 오티 닐화 된 소 랄렌을 사용하여 근접 결합 및 높은 처리량 시퀀싱을 수행 한 P soralen crosslinked, Ligated 및 Sided H ybrids (SPLASH)의 S equencing을 수행하기위한 세부 사항을 설명합니다. 게놈 전체 RNA base-pairing 파트너를 확인하십시오 ( 그림 1 ). 이 원고에서 배양 된 접착 세포,이 경우에는 HeLa 세포를 사용하여 SPLASH를 수행하는 단계를 설명합니다. 동일한 프로토콜은 포유 동물 현탁액 및 효모 및 박테리아 세포에 쉽게 적용될 수 있습니다. 간략하게, HeLa 세포를 바이오 티 닐화 된 소 랄렌으로 처리하고 생체 내에서 상호 작용하는 RNA 염기 쌍을 가교 결합시키기 위해 365 nm에서 조사 하였다. 그런 다음 RNA를 세포에서 추출하고 스트렙 트 아비딘 (streptavidin) 구슬을 사용하여 가교 결합 영역을 강화하고 단편화합니다. 인터랙 팅 RNA 단편은 근접 결합을 사용하여 함께 결찰되고 심층 시퀀싱을위한 cDNA 라이브러리로 만들어진다. 시퀀싱시 키메라 RNA는 transcriptome / genome에 매핑되어 서로 쌍을 이루는 RNA 상호 작용 영역을 식별합니다. 우리는 SPLASH를 이용하여 snoRNA, lncRNA 및 mRNA와 같은 RNA의 다양한 부류에서 분자 내 및 분자간 RNA 염기 쌍 형성을 비롯하여 구조 조직 및 상호 작용 패턴을 엿볼 수있는 효모 및 다른 인간 세포 에서 생체 내 에서 수천 건의 RNA 상호 작용을 확인했습니다 세포에서 RNA의.

<table><tbody><tr><td>1 kb 플러스 DNA 사다리</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td>DNA 사다리</td></tr><tr><td>10 bp DNA 사다리</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>DNA 사다리</td></tr><tr><td>20% SDS 솔루션</td><td>First BASE</td><td>BUF-2052-1L&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>첫 번째 베이스</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M 나트륨 아세테이트 용액</td><td>첫 번째 베이스</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&nbsp; &nbsp;</td><td>핵산 침전에 필요</td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/비스 솔루션, 19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE 요소 젤 구성</td></tr><tr><td>요소 Ambion Buffer Kit</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 퍼설페이트, 분자 등급&nbsp; &nbsp;</td><td>프로메가</td><td>V3131&nbsp;</td><td>TBE 우레아 젤 성분</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>단일 가닥 DNA 리가제</td><td>진앙</td><td>CL9025K</td><td>CircLigase II ssDNA 리가제</td></tr><tr><td>원심관 필터</td><td>시그마-알드리치</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X 원심분리기 튜브 필터</td></tr><tr><td>D5628-1G 디지토닌 결정질</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>세포 치료용</td></tr><tr><td>다크 리더 트랜스일루미네이터&nbsp;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader DR89X Transilluminator</td><td>Blue light transilluminator</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>아가로스 젤 electroporation에 필요</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Pan BioTech</td><td>P04-03500</td><td>Hela 세포 배양</td></tr><tr><td>Streptavidin 마그네틱 비드</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne 스트렙타비딘 C1&nbsp;</td></tr><tr><td>15&nbsp를 위한 자석 스탠드; mL 튜브</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>자석 스탠드 15&nbsp; mL 튜브</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td></tr><tr><td>Biotinylated psoralen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>히타치</td><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>365nm UV 전구</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp; &nbsp;</td><td>Hela 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>프로메가</td><td>H5052&nbsp; &nbsp;</td><td>혼성화 버퍼의 구성 요소</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>254 nm UV 전구</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>핵산 침전에 필요</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Nanodrop 2000</td><td>핵산 정량화를 위한 분광광도계</td></tr><tr><td>Nuclease 무료 물&nbsp;</td><td>첫 번째 베이스</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신&nbsp; &nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지스 홀딩스 Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp; &nbsp;</td><td>Hela 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>고화질 DNA 중합효소 (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Phusion High-Fidelity PCR HF Buffer를 사용한 마스터 믹스(2x)</td></tr><tr><td>프라이머 세트 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>PCR 프라이머</td></tr><tr><td>DNA 겔 추출 키트</td>, <td>QIAgen</td><td>28106</td>, <td>QIAquick 겔 추출 키트</td></tr><tr><td>, 형광 측정 정량화 키트</td>, <td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td>, <td>Q32854</td><td>Qubit, dsDNA HS 분석 키트</td></tr>, <tr><td>RNA 클린업 키트</td><td>, Qiagen</td><td>74106</td>, <td>RNeasy Mini Kit, 실리카멤브레인 컬럼</td></tr>, <tr><td>Rnase 억제제,</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td>, <td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>역전사 효소</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix</td></tr><tr><td>핵산 겔 Stain</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL</td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>End repair enzyme</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzyme for 근접 결찰</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2, truncated KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>어댑터 결찰용 효소</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE 우레아 겔 성분</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg; RNA 추출 시약</td></tr><tr><td></td><td>Urea First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>밴드 시각화용</td></tr><tr><td>Xylene Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>DNA 정리 Zymo</td><td>Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>Zymo DNA 집중기-5&nbsp;</td></tr><tr><td>필요한 소프트웨어 목록</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC 소프트웨어</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>SeqPrep 소프트웨어</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>BWA 소프트웨어</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>SAMTOOLS 소프트웨어</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>PULLSEQ 소프트웨어</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>STAR 소프트웨어</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py PYTHON 스크립트</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py PYTHON 스크립트</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk AWK 스크립트</td><td>AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>Buffer composition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strongElution buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 M sodium acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>항상 Superase-in을 사용 전에 신선하게 추가하십시오. 단, 세척할 때를 제외하고<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Proteinase K Buffer&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 % 포름 아미드 (4 °C에서 암흑 보관; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>사용</td><td></td><td></td><td></td> 전에 항상 Superase-in을 신선하게 첨가</tr><tr><td>하십시오2x SSC 세척 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x NaCl 및 구연산나트륨(SSC)(20x SSC Invitrogen stock에서 희석)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x RNA 단편화 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x RNA 로딩 염료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% 포름아미드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02% 브로모페놀 블루</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01 % 크실렌 시아 놀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr> <<tr>td colspan = "4">3 'RNA 어댑터 서열 : 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RT 프라이머 시퀀스: 
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

biotinylated psoralen을 사용하여 rna-rna 상호 작용을 세계적으로 매핑

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA가 어떻게 상호 작용 하는지를 아는 것은 세포에서 RNA 기반의 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. microRNA-mRNA 상호 작용과 같은 RNA-RNA 상호 작용의 예가 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타 났지만 RNA 상호 작용이 세포에서 일어나는 전체 범위는 아직 알려지지 않았습니다. RNA 상호 작용을 연구하기위한 이전의 방법은 주로 특정 단백질 또는 RNA 종과 상호 작용하는 RNA의 부분 집합에 초점을 맞추었다. 여기에서는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S elected H ybrids (SPLASH)라는 이름의 방법을 상세히 설명합니다.이 방법을 사용하면 생체 내 에서 RNA 상호 작용 을 편파적으로 캡처 할 수 있습니다. SPLASH는 생체 내 교차 결합, 근접 결합 및 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분자 내 및 분자간 RNA 염기쌍 파트너를 세계적으로 확인합니다. SPLASH는 박테리아, 효모 및 인간 세포를 포함한 다른 유기체에 적용 할 수 있습니다.다양한 세포 환경에서 RNA 조직의 역 동성을 이해하는 데 도움이되는 다양한 세포 조건을 제공합니다. 전체 실험 SPLASH 프로토콜은 완료하는 데 약 5 일이 걸리고 계산 워크 플로는 완료하는 데 약 7 일이 걸립니다.

그림 1 은 SPLASH 워크 플로우의 개략도입니다. 0.01 % digitonin 존재 하에서 biotinylated psoralen을 첨가하고 UV 가교 결합시 total RNA를 세포에서 추출하고 dot blot을 수행하여 RNA에 대한 biotinylated crosslinking이 효율적으로 일어 났는지 확인합니다 ( 그림 2 ). 우리는 biotinylated 20 base oligos를 양성 대조군으로 사용하여 biotinylated psoralen의 양을 세포에 첨가하여 150 개의 염기가 약 1 개가 가교되도록합니다. 더 많은 PCR 복제 이벤트가 증가 된 PCR 증폭 사이클에서 발생하는 경향이 있으므로, 우리는 깊은 시퀀싱을위한 충분한 ...

여기에서는 생체 내에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑을 가능하게하는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S - selected Hysbrids (SL)의 S equencing 방법을 자세히 설명합니다. SPLASH는 효모, 박테리아 및 인간을 포함한 유기체의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 적용 할 수 있습니다.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

이 영상의 전반적인 목적은 게놈 전반에 걸쳐 쌍을 이루는 in vivo RNA-RNA 상호작용을 매핑하는 psoralen 가교 결합 및 선택적 하이브리드 시퀀싱(SPLASH) 방법을 설명하는 것입니다. 이 기술은 in vivo에서 RNA 상호작용을 매핑하기 위한 단순하고 고효율인 방법입니다. 이 방법은 단일 RNA 가닥의 서로 다른 영역 간 또는 서로 다른 RNA 가닥 간에 어떻게 상호작용하는지와 같은 RNA 게노믹스 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 효모 및 인간 세포에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 박테리아 및 세포 내 막을 포함한 다른 현대 유기체 연구에도 적용될 수 있습니다. 저희는 분자 상호작용을 매핑하는 방법을 고안하고자 했을 때 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다. 다음 절차에는 여러 중단 지점이 포함되어 있음에 유의하십시오.이 시점에서 실험을 잠시 또는 무기한으로 중단할 수 있습니다. 자세한 내용은 동반 텍스트에서 확인할 수 있습니다. HeLa 세포를 5 mL의 PBS로 두 번 세척하여 이 절차를 시작하십시오.디쉬를 수직으로 세워 1분 동안 남은 PBS를 완전히 제거합니다. 그다음, 세포 투과성을 높여주는 200 µM의 biotinylated psoralen과 0.01% digitonin이 포함된 PBS 1 mL를 첨가합니다. 이때 용액이 세포 표면에 고르게 분산되도록 주의하여 첨가하십시오.37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 디쉬의 뚜껑을 제거하고 UV Crosslinker 내의 UV 램프로부터 3 cm 떨어진 얼음 위에 배치합니다. 365 nm UV로 20분 동안 조사합니다.20분 후, Crosslinker에서 디쉬를 꺼낸 다음, 동봉된 문서의 지침에 따라 HeLa 세포에서 단편을 분리하고 RNA를 침전시킵니다. 변성 래더와 RNA 샘플을 8.6 centimeter 정사각형 6%TBE-urea 겔에 로딩합니다. 180 volts에서 40분 동안 전기영동하여 크기별로 분획합니다.핵산 젤 염색액을 1:10,000로 희석한 10 mL TBE 버퍼에서 젤을 5분 동안 암소에서 염색합니다. 젤이 염색되는 동안 24게이지 바늘을 사용하여 깨끗한 0.6 mL 마이크로퓨지 튜브의 바닥에 구멍을 냅니다. 이를 2 mL 마이크로퓨지 튜브 안에 넣습니다.트랜스일루미네이터를 사용하여 염색 후 겔의 밴드를 시각화하고, 90에서 110 뉴클레오타이드에 해당하는 겔 조각을 절단합니다. 절단한 겔 조각을 2 mL 마이크로 튜브 안에 들어 있는 구멍 뚫린 0.6 mL 마이크로 퓨지 튜브로 옮깁니다. 크기 선택을 통해 키메라 단편의 최소 길이를 설정하고, 이후에 라이게이션된 생성물과 라이게이션되지 않은 생성물을 구분할 수 있습니다.겔 슬라이스를 상온에서 12,000 ×g로 2분 동안 원심분리하여 겔 슬라이스를 분쇄하고 2 mL 마이크로퓨지 튜브에 수집합니다. 원심분리 후, 빈 0.6 mL 마이크로퓨지 튜브는 폐기합니다. 분쇄된 겔 슬라이스에 700 µL의 용출 버퍼를 첨가합니다.시료가 버퍼로 확산될 수 있도록 4 °C에서 지속적으로 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 겔 조각과 용출 버퍼를 원심분리 튜브 필터로 옮기고 20,000 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 겔 조각은 필터의 상단 구획에 남게 되며 이는 폐기해도 됩니다.동봉된 문서에 설명된 대로 RNA를 침전시키고 정량하십시오. RNA를 액체 질소로 급속 냉동한 후 사용 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. RNA 가교 영역을 농축하려면, 먼저 마이크로 원심분리기 튜브에 담긴 streptavidin 코팅 자성 비즈를 세척하기 위해 RNase 억제제가 포함된 용해 버퍼 100 µL를 첨가하는 것으로 시작하십시오.15밀리리터 원추형 원심분리관에 갓 조제한 하이브리드화 완충액 2밀리리터, 보충된 용해 완충액 1밀리리터, 크기 분획된 RNA 1.5마이크로그램, 그리고 재부유시킨 비드 100마이크로리터를 넣습니다. 튜브를 부드럽게 볼텍싱합니다. 37도로 설정된 온도에서 30분 동안 상하 회전시키며 배양합니다.배양 후, 미리 데워둔 세척 완충액으로 비드를 5회 세척합니다. 5번째 세척이 끝나면 비드가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 자석 스탠드에 1분 동안 놓은 다음 세척 완충액을 제거합니다. 세척된 비드에 차가운 T4 polynucleotide kinase 완충액 1 mL를 첨가합니다.비즈를 4°C에서 5분 동안 상하 회전하며 배양하십시오. 비즈가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 마그네틱 스트립 위에 놓으십시오. 1분 후, 완충액을 조심스럽게 제거하십시오.이 단계를 총 2회 반복하여 세척하고, 마지막 세척 후 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 동봉된 문서의 지침에 따라 5' 말단과 3' 말단을 라이게이션 가능하게 변환하고 근접 라이게이션(proximity ligation)을 수행합니다. 세척 후, 비드에 100 µL의 RNA PK buffer를 추가하고 피펫팅하여 다시 현탁합니다.히팅 블록에서 샘플을 95 °C로 10분 동안 가열합니다. 다음으로, 샘플을 얼음 위에서 1분 동안 냉각합니다. 샘플에 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 500 µL를 첨가합니다.10초 동안 강하게 볼텍싱하여 혼합합니다. 혼합물을 상온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후, 키트를 사용하여 RNA를 침전, 정제 및 회수하며, 이때 소형 RNA까지 모두 보존되도록 합니다.nuclease-free water 100 µL로 RNA를 용출합니다. 용출된 샘플 100 µL를 얼음 위에 놓인 24-well 플레이트의 웰로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 유지한 상태에서 254 nm의 UV를 5분 동안 조사합니다.역가교된 샘플을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 10 µL의 sodium acetate, 1 µL의 glycogen, 그리고 300 µL의 100% ethanol을 첨가합니다. -20 °C에서 최소 1시간 동안 RNA를 침전시킵니다.RNA를 회수하기 위해, 침전된 RNA를 4°C에서 20,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 70% 차가운 에탄올 1 mL를 첨가하여 RNA 펠릿을 세척합니다. 세척된 펠릿을 4°C에서 20,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다.세척 버퍼를 제거하고 nuclease-free water 4.25 µL를 첨가하여 RNA를 재현탁합니다. RNA를 0.2 mL PCR 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 동봉된 문서의 지침에 따라 cDNA를 역전사, 원형화 및 증폭합니다.이 도식은 SPLASH 워크플로를 나타냅니다. 0.01% digitonin 존재 하에 비오틴화된 psoralen을 첨가하고 UV 가교를 수행한 후, 세포에서 총 RNA를 추출하고 dot blot을 실시하여 가교가 효율적으로 이루어졌는지 확인합니다. 그 다음, 비오틴화된 20 base oligo를 양성 대조군으로 사용하여, 약 150개 염기당 하나가 가교될 수 있도록 세포에 첨가할 비오틴화된 psoralen의 양을 적정합니다.그 다음, 딥 시퀀싱(deep sequencing)에 필요한 최소 사이클 수를 결정하기 위해 PCR 사이클 수를 늘려가며 소규모 PCR 증폭을 수행합니다. 효율적인 라이브러리 제작 과정에서는 크기 선택(size selection)을 거친 1.5 µg의 RNA 입력물로부터 15회 미만의 PCR 증폭 사이클 내에 cDNA 시퀀싱 라이브러리를 증폭할 수 있습니다. 이후 고처리량 시퀀싱 장비를 사용하여 두 개의 150 bp 리드(read)로 라이브러리를 시퀀싱합니다.이후 시퀀싱 리드는 계산 파이프라인에 따라 처리됩니다. 최종 결과는 전사체 내의 분자 내 및 분자 간 RNA-RNA 상호작용을 모두 포함하는 필터링된 키메라 상호작용 목록입니다. 이 절차를 시도할 때, 새로운 생물체에 SPLASH를 사용하는 경우 비오틴화된 소랄렌(biotinylated psoralen)의 결합 여부를 확인하는 것이 중요함을 기억하십시오.이 기술의 개발 이후, RNA 생물학 분야의 연구자들은 다양한 생명체 내의 RNA 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 세포 내 전체의 쌍별 RNA 상호작용을 포착하는 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

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빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

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레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

배우세요 SPLASH 방법을 사용하여 생체 내 RNA-RRNA 상호작용을 게놈 전체적으로 매핑하는 기술을. 효모, 박테리아, 인간 세포 등 다양한 생물체에 적용 가능한 고효율 RNA 상호작용 분석법입니다.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

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