電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

この技術の全体的な目標は、組織を著しく劣化させることなく、ニューロン組織を長期間維持することです。この方法を用いると、組織抽出後24時間以上経過した時点で電気生理学的記録およびカルシウムイメージングを行うことができる。この方法は、急性に抽出されたニューロン組織の生存率を大幅に向上させ、その生存率を24時間以上維持し、急性組織インキュベーションの新たなゴールドスタンダードを設定します。

この技術の主な利点は、組織を利用できる実験時間が大幅に増加することです。これにより、必要な動物の数が減り、各実験から得られるデータ量が最大化されます。ブラインキュベーターは、組織の温度を維持し、細胞外液中の細菌の増殖を防ぐ自動システムです。

これにより、組織に厳密に制御された環境が提供されます。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるOrsolya KekesiとAlba Bellot-Saezです。脳スライスの調製には、ビブラトームで関心領域を含む厚さ300マイクロメートルの脳スライスを準備します。

次に、スライスをカルボゲンフロー、pHレベル、および温度制御された特注のインキュベーションシステムに移します。チャンバーの初期温度を摂氏35度に15〜30分間設定し、その後ゆっくりと摂氏15度まで下げます。その後、インキュベーションシステム内でスライスをインキュベートし、電気生理学の記録またはイメージングを行います。

網膜全体のマウント調製のために、安楽死させた動物から直ちに眼を摘出します。オラセラータに沿って小さな切り込みを入れ、目とエイムズ培地またはカルボゲン供給を含むaCSFを室温で置きます。その後すぐに小さなハサミでora serrataに沿って切断し、鉗子でそれらを取り除き、角膜、水晶体および硝子体を取り除きます。

組織を室温のインキュベーションシステムに入れます。内側の限界膜を取り除くには、網膜を含むアイカップをパパイン、L-システイン、EDTA、DNaseが入った小さなガラス瓶に摂氏37度で20分間移します。.蓋を通して溶液にカルボゲンを塗布しますが、泡立たないでください。

組織をアールのBSSで10分間オボムコイドとBSA溶液に入れて、酵素消化を停止します。.次に、組織をaCSFで十分に洗浄します。続いて、組織をインキュベーションシステムに移し、温度を約15〜16°Cに下げます。

その後、網膜組織を顕微鏡に移します。アイカップから網膜を分離し、かみそりの刃で4つに切ります。網膜全体が必要な場合は、網膜の周囲に4つの小さな切り込みを入れて、網膜が平らになるようにします。

この組織は、電気生理学のために顕微鏡に移したり、ブラインキュベーターで維持したりすることができます。組織は、pHおよび温度測定用のプローブを含むメインチャンバーに保持されます。第2のチャンバーはメインチャンバーから隔離され、溶液中に浮遊する細菌を照射するために1.1ワットのUVC光

蠕動ポンプを使用して2つのチャンバーにCSFを循環させ、ペルチェ熱電冷却プレートを使用してメインチャンバーを冷却または加熱します。この手順では、カルシウム染料をDMSOに溶解して1ミリモル溶液を作ります。混合物に1%プルロン酸F-127を加えて、最終容量50マイクロリットルを達成します。

その後、10分間超音波処理します。カルシウム染料を2.5ミリリットルのaCSFで希釈したガラスローディングチャンバーを準備し、脳スライスの最終濃度を10マイクロモル、網膜を20マイクロモルの最終濃度にします。若い動物の網膜および脳切片の場合は、サンプルを浴中で45分間インキュベートします。

成体動物の場合は、25マイクロリットルの染料を直接脳切片にピペットで入れ、75分間保持して、染料が深層に浸透しやすくします。色素インキュベーション中に水中組織の適切な酸素化を確保するために、蓋を通してカルボゲンで連続的に酸素化しますが、泡立たないでください。色素をロードした後、組織をaCSFで洗浄し、インキュベーションシステムに移します。

使用するまで、温度を摂氏約15〜16度にゆっくりと下げます。記録には、顕微鏡下の水中記録チャンバーに組織を入れ、毎分4〜5ミリリットルの流量で酸素化aCSFを灌流します。カスタムメイドのハープを使用してティッシュを保持します。

次に、マイクロピペットプーラーを使用していくつかの録音ピペットを準備し、5〜6メガオームの最終抵抗を達成します。ピペットに3〜4マイクロリットルの内部溶液を入れ、溶液を氷の上に置きます。次に、IR-DICの下でCCDカメラを使用して細胞を視覚化します。

マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットを細胞膜上に配置します。ピペットホルダーの吸引ポートを通じて陽圧を維持します。ピペットをセルに取り付けたら、ピペットに穏やかな負圧を加えてギガオームシールを実現します。

次に、細胞膜を短時間の負圧で破裂させます。その後、全セル電流または電圧クランプの記録を開始します。Fura-2のレシオメトリックイメージングには、超高速波長スイッチャーを使用して、340ナノメートルと380ナノメートルの励起波長を提供します。

次に、放出された光を高感度、高速デジタルカメラで省略フィルターを通してキャプチャします。Fluo-4の単一励起波長の場合、励起光を460〜490ナノメートルのバンドパスフィルターでフィルタリングし、放出された光を515〜550ナノメートルのバンドパスフィルターでろ過します。消化後、網膜神経節細胞と変位したアマクリン細胞をDIC照明下で明確に視覚化でき、内部制限膜を事前にこすり取ることなくパッチクランプ記録の標的にすることができます。

網膜神経節細胞からの代表的な電流クランプ記録をここに示します。パッチピペットによる細胞の脱分極は、パパイン治療後の細胞の生存率を示す用量依存的な活動電位生成を引き起こしました。また、内側の限界膜を取り外すことで、Fura-2 AMによる神経節細胞層の遍在的な染色が可能になりました。そして、細胞は30ミリモルの塩化カリウムの適用に応答し、F0に対して342〜380ナノメートルの比率の増加によって証明されるように、細胞内カルシウム濃度の大幅な増加を示しました。塩化カリウムの適用後、カルシウムレベルは刺激後にベースラインに戻りました。

そして、その後、細胞を刺激して、同様の振幅応答を生成することができました。さらに、これらの反応は、解剖後4時間未満で記録された網膜と24時間以上で記録された網膜とで区別がつかなかった。この手順を試みる際には、急性神経組織は環境的に無防備であることを覚えておくことが重要です。

したがって、pH、温度、細菌レベルの綿密なモニタリングによるaCSFの厳密な制御は、細胞活性とネットワークの完全性を維持するために不可欠です。この手順は、無菌技術を必要とせず、生理機能に影響を与える可能性のある成長因子や抗生物質を含む培地を使用せずに、ニューロン組織を24時間以上維持するために使用できます。この方法が、組織の生存率を最大化するための理想的なパラメーターのゴールドスタンダードを設定することを願っています。

これにより、組織自体の健康状態のばらつきが減少し、その結果、実験のばらつきが減少します。パパインプロトコールを使用して網膜の内側の限界膜を消化すると、カルシウム色素による遍在染色が可能になります。このプロトコールは、神経節細胞層のニューロンから多部位の細胞内記録を取得するためにも使用できます。

このビデオを見れば、イメージングや電気生理学的実験のために生存組織を24時間以上維持する方法を十分に理解できるはずです。紫外線での作業は危険な場合があることを忘れないでください。この手順を実行するときは、常に保護眼鏡などの予防策を着用する必要があります。