Name: 바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 하이브리드 β-lactamase 기반 전도성 바이오센서 분석법을 이용하여 항체-항원 상호작용을 검출하는 방법을. 이 기술은 전통적인 면역센서보다 빠르고 경제적인 실시간 단백질 결합 분석을 가능하게 합니다.

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저자는 SENSOTEM 및 NANOTIC 연구 프로젝트의 프레임 워크 내에서 벨기에의 왈 롱 지역 뿐만 아니라 국가 자금에 대 한의 과학 연구 (F.R.S.-F.N.R.S) 그들의 재정 지원에 대 한 인정합니다.

1. 단백질 샘플 준비
<ol><li>고 정화 하이브리드 단백질 BlaP-택시-Lys3로 우리의 이전 연구15에 보고 합니다. 50 m m 인산 버퍼 pH 7.4 다음 구성에서에서 단백질을 저장: 8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나2HPO4 의 1.44 g, KH2포4 증류수 800 mL에 용 해의 0.24 g 수정 전에 7.4 해결책의 pH 1 솔루션의 최종 볼륨을 조정 L. 필터 단백질 해결책 소독.</li>
	<li>암 탉 달걀 흰 lysozyme (HEWL) 재고 솔루션을 준비 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS 단계 2.1.1 참조) 10 mL에 상업적으로 구입한 HEWL의 100 밀리 그램 (40000 단위/mg)을 분해. 0.22 μ m 휴즈와 필터를 사용 하 여 여과 하 여 단백질 해결책 소독.</li>
</ol>2. 바이오 센서 분석 실험
<ol><li>
솔루션 및 버퍼 준비
	<ol>
<li>8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나2HPO4, 1.44 g 및 KH2포4 증류수 800 ml에서의 0.24 g을 용 해 하 여 50 mM PBS를 준비 합니다. 1 나 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장 솔루션의 볼륨을 조정 하기 전에 pH 7.4 1에 N HCl 또는 1 N NaOH 조정</li>
		<li>카 제인의 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 ml에서의 3 g을 용 해 하 여 채도/차단 솔루션을 준비 (2.1.1 단계 참조). 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
		<li>카 제인의 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 ml에서의 1 g을 용 해 하 여 바인딩 솔루션 준비 (2.1.1 단계 참조). 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
		<li>세척 솔루션 준비 (0.1% 트윈-PBS) 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 mL에 트윈 20 (100%)의 100 μ를 추가 하 여 (2.1.1 단계 참조). 4 ° c.에 게</li>
		<li>전극 준비 솔루션 준비 (1% 트라이 톤 X-100-PBS) 100 ml PBS 준비 위에서 설명한 대로의 트라이 톤 X-100 (100%)의 1 mL을 추가 하 여 (2.1.1 단계 참조). 4 ° c.에 게</li>
		<li>최종 볼륨을 증류수에 KCl의 26 g을 용 해 하 여 전극 재생 솔루션 (3.5 M KCl) 준비 100 mL. 살 균 필터와 4 ° c.에 게</li>
		<li>1 나 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장의 최종 볼륨을 증류수에 NaCl의 0.29 g를 용 해 하 여 5 mM NaCl 솔루션을 준비 그런 다음, 5 mM NaCl 솔루션의 20 mL에 benzylpenicillin의 26.7 mg를 용 해 하 여 탐지 솔루션 (4 m m benzylpenicillin)를 준비 합니다. 필터를 소독 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
센서 준비 및 재생 참고:는 폴리아닐린 코팅 센서 칩 개발 하 고 친절 하 게 박사 P. Bogaerts, 닥터 미 유 누스 교수부터 Y. Glupczynski의 (가톨릭 대학교의 루 베인 라-브-추 몽-Godinne)에 의해 제공 되었다. 폴리아닐린 전기 합 프로토콜 이러한 센서를 합성 하는 데 사용 되는 센서의 설명 그들의 이전 일17에 자세히 나와 있습니다. 간단히,이 시스템은 고전 인쇄 회로 기판 (PCB) 기술에 의해 제조 된 8 개의 개별 칩의 재사용 가능한 센서를 사용 합니다. 개별 칩 3 개의 전극으로 구성 된 라운드 명소. 상위 1은 작업 전극은 폴리아닐린에 전기 합성 했다. 중간에 한 참조 전극 이며 하단 전극 구성 카운터 전극. 둘 다, 참조 및 카운터 전극은 기능성 탄소 레이어 위에 단단한 Ag/AgCl 혼합을 사용 하 여.<ol>
<li>3 세척 전극의 전극 준비 솔루션의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 여 수행 (1% 트라이 톤 X-100-PBS, 참조 단계 2.1.5.). 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.</li>
		<li>실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 증류수의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 하 여 전극 린스.</li>
		<li>포함 하는 재생 솔루션의 300 µ L/잘 96 잘 접시의 우물으로 팁을 찍기 여 전극을 다시 생성 (3.5 M KCl, 단계 2.1.6 참조) 4 ° C 또는 실 온에서 1 h에서 하룻밤.</li>
		<li>인산 염 버퍼 염 분의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 하 여 전극의 3 세척을 수행 (2.1.1 단계를 참조 하십시오.). 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
센서에 수행 분석 결과 바인딩
	<ol>
<li>40 µ g/mL PBS에서 준비 하는 전극 표면에 HEWL의 15 µ L 드롭 입금 하 여 전극의 PANI (폴리아닐린) 표면 코트 HEWL. 4 ° C 또는 실 온에서 1 시간에서 밤새 품 어.</li>
		<li>인산 염 버퍼 식 염 수와 전극의 3 개의 세척을 수행 (2.1.1 단계 참조) 포함 하는 인산 염 버퍼 염 분의 300 µ L/잘 96 잘 접시의 우물으로 센서 칩의 전극 부분을 찍기로. 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.</li>
		<li>50 µ L 방울 차단 솔루션을 추가 하 여 전극 포화 (단계 2.1.2 참조) 전극 표면에. 실 온에서 1 h에 품 어. 다음 단계 (단계 2.3.2 참조)는 이전에 설명 된 대로 세 번 세척.</li>
		<li>BlaP-택시-Lys3 솔루션 바인딩 솔루션에서 20 µ g/mL를 희석 (단계 2.1.3 참조) 15 µ L 방울 전극에 희석된이 솔루션을 적용. 실 온에서 10 분 동안 품 어. 항 원-nanobody 반응 후 세척 솔루션을 사용 하 여 이전 단계에서 세척을 3 번으로 설명 (2.1.4 단계 참조). 다음 한 번 PBS와 전극 린스 (2.1.1 단계 참조).</li>
		<li>검색, 디지털 멀티 미터에 구리 회로 부분을 통해 센서 칩을 연결 합니다. 그런 다음 50 µ L 방울 탐지 솔루션을 적용 하 여 센서 응답 시작 (단계 2.1.7 참조) 긍정적인 전극에 적용 (단계 2.1.7 참조) 부정적인 전극에 NaCl 5mm 솔루션의 50 µ L 드롭. 실 온에서 30 분 동안 품 어. 디지털 멀티 미터와는 전도성을 모니터링 합니다. 참고:는 멀티 미터 박사 P. Bogaerts, 닥터 미 유 누스 교수부터 Y. Glupczynski의 (가톨릭 대학교의 루 베인 라-브-추 몽-Godinne에 의해 제공 된. 이 potentiostat 컴퓨터 USB 포트를 통해 제어 하 고 동시에 센서의 8 개의 서로 다른 칩을 분석 합니다. 유 누스와 동료17 에 의해 만들어진 소프트웨어는 실시간 플롯 시간에 대 한 참조 및 샘플 전극의 전도도 차이의 측정을 나타내는 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 작품에서는 캐리어 단백질으로 BlaP β-lactamase를 사용 하 여 nanobody를 functionalize 하는 방법을 소개 하 고 우리는 우리가 성공적으로 구현할 수 결과 하이브리드 단백질 potentiometric 센서 분석 결과 보여. 다른 바이오 센서 분석 실험에 비해 우리의 작업의 주요 혁신 측면은 전기 신호를 생성 하는 효소 활동을 항 체 부분의 공유 결합. 이 소위 단백질 삽입 기술 선물 장점과 한계가이 섹션의 주요 초점이 될 것입니다.
하이브리드 β-lactamase 기술의 장점입니다.
Β-lactamases는 효율적인 효소 감도는 바이오 센서의 신호 대 잡음 비율에 영향을 주는 가장 중요 한 매개 변수 중 하나는 신호를 생성 하는 데 사용 하는 효소 활동입니다. 이러한 맥락에서 β-lactamases 여러 장점을 제시: 그들은 작은 (≈29 kDa), 단위체, 매우 안정, 그리고 더 중...

바이오 센서는 바이오 분자 상호 변환기1이라고 하는 물리적 또는 화학적 신호 장치를 결합 하는 분석 장치. 기록 된 신호 다음 해석 하 고 고정 및 무료 파트너 간의 상호 작용을 모니터링 변환할 수 있습니다. 바이오 센서의 대부분은 호르몬 등 다른 병원 체 마커2analytes를 검출 하는 항 체의 사용을 포함. 다른 센서 형식을 사용할 수 있습니다 하 고 질량, 자석, 광학 또는 전기 화학 바이오 센서를 포함 합니다. 후자는 가장 일반적으로 사용 되는 센서, 그리고 바인딩 이벤트를 전기 신호로 변환 하 여 작동. 공연 및 모든 항 체 기반 바이오 센서의 감도 기본적으로 두 개의 매개 변수에 강하게 의존: i)는 항 체와 ii)2신호 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 속성의 품질.
항 체는 2 개의 무거운 사슬과 2 개의 가벼운 사슬 구성 높은 분자 질량 dimeric 단백질 (150-160 kDa). 빛과 무거운 사슬 사이 상호 작용은 주로 소수 성 상호 작용 보존된 이황화 결합에 의해 안정 된다. 각 체인에는 본질적으로 보완 결정 영역 (CDR1-2-3) 라는 3 하이퍼 영역을 통해 항 원와 상호 작용 하는 변수 도메인 포함 되어 있습니다. 필드, 낮은-비용 식 시스템 (예를 들면, 대장균) 전체 길이 항 체의 대규모 식에서에서 수많은 진보에도 불구 하 고 종종 불안정 하 고 집계 된 단백질의 생산에 지도 한다. 이 때문에 단일 체인 변수 조각3 (ScFvs ≈ 25 kDa)와 같은 다양 한 항 체 파편을 설계 되었습니다 있다. 그들은 각각 한 중 고 covalently는 합성 아미노산 서 열에 의해 연결 된 1 개의 경 쇄의 가변 도메인 구성 됩니다. 그러나,이 파편은 종종 가난한 안정성 표시 하 고 집계, 때문에 그들은 그들의 소수 성 영역 용4의 큰 부분을 노출 하는 경향이 있다. 이러한 맥락에서 단일 체인 camelid 항 체 단편, nanobodies 또는 VHHs, ScFvs에 대 한 우수한 대안을 것 같다. 이러한 도메인 camelid 단일 체인 항 체의 가변 도메인에 해당합니다. 기존의 항 체, 달리 camelid 항 체 경 쇄가 없는 고 두 무거운 체인5포함. 따라서, nanobodies는 가장 작은 단위체 항 체 파편 (12 kDa) 기존의 항 체6의 선호도와 항 원에 바인딩할 수 있습니다. 또한, 그들은 향상 된 안정성과 가용성 다른 전장 항 체 또는 항 체 파편에 비해 제시. 마지막으로, 그들의 작은 크기와 그들의 확장된 CDR3 루프 그들이 이상한 epitopes를 인식 하 고 효소 활성 사이트7,8바인딩할 수 있습니다. 요즘, 이러한 도메인 상당한 관심을 받고 있다 고 바이오 센서 기술에 결합 되었습니다. 예를 들어 황은 외. 탐지 및 정량화 인간 전립선 특정 항 원 (PSA)9의 nanobody 기반 바이오 센서를 개발 했습니다.
언급-위, 바이오 센서 분석에 중요 한 매개 변수는 전기 신호를 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 효율성. 이러한 이유로, 효소 기반 전기 화학 바이오 센서 증가 관심을 받고 있다 고 건강 관리, 식품 안전, 환경 모니터링 등 다양 한 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 이 바이오 센서는 전기 신호를 생성 하는 효소에 의해 기판의 촉매 가수분해에 의존 합니다. 이러한 맥락에서 β-lactamases 더 구체적인, 더 과민 하 고 알칼리 성 인산 가수분해 효소 또는 양 고추냉이 과산화 효소10같은 많은 다른 효소 보다 실험적으로 구현 하기 더 쉬운 것 표시 했다. Β-lactamases 효소 그들을 hydrolyzing 하 여 β-락탐 항생제를 세균성 저항에 대 한 책임은 있습니다. 그들은 작은 크기의 단위체, 매우 안정, 효율적인, 그리고입니다. 또한, β-lactamases에 도메인/펩 티 드 삽입 생성 bi 기능 공상 단백질 단백질-리간드 상호작용을 연구 하는 효율적인 도구 표시 했다. 실제로, 최근 연구의 대상 항 원에 높은 선호도와 바인딩할 수 남아 공상 단백질에서 TEM1 β-lactamase 결과 항 체 변수 조각의 그 삽입을 나타났습니다. 흥미롭게도, 항 원 바인딩 TEM1 촉매 활동11,12의 allosteric 규칙 유도 표시 했다. 또한, 우리는 단백질 도메인 삽입 허용 루프에 균 licheniformis BlaP β-lactamase 단백질-리간드 상호작용13 모니터링 하는 기능 공상 단백질 생성 여러 연구에서 보였다 ,14. 우리는 최근 택시-Lys3, BlaP15이 허용 삽입 사이트에 명명 하는 nanobody를 삽입. 이 nanobody 암 탉 달걀 흰 lysozyme (HEWL)에 바인딩할 및16의 효소 활동 억제 하기 위해 표시 했다. 우리는 생성 된 하이브리드 단백질, BlaP-택시-Lys3, 라는 높은 특이성을 유지 / HEWL β-lactamase 활동 동안에 대 한 선호도 그대로 보였다. 그럼 우리가 성공적으로 β-lactamase 기술 하이브리드는 전기 화학 바이오 센서를 결합 하 여 생성 된 전기 신호 양을 했다 BlaP-택시-Lys3와 HEWL는 전극에 움직일 수 간의 상호 작용에 따라 다릅니다. 실제로, BlaP에 의해 β 락탐 항생제의 가수분해 양성자 방출 양적 전기 신호로 변환할 수 있는 유도 합니다. 이 조합은 전기 화학 바이오 센서와 하이브리드 β-lactamase 기술의 빠른, 민감한, 양적, 이며 생성 된 신호의 실시간 측정을 수 있습니다. 이 방법론은 여기 설명 되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>V000225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris&ndash; HCl</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>시그마-알드리히트</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리히트</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>알라닌</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>HClO4</td><td>Fluka</td><td>34288</td><td>1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht</td></tr><tr><td>casein hydrolysate</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>22090</td><td></td></tr><tr><td>benzylpenicillin sodium</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>B0900000</td><td></td></tr><tr><td>암탉 달걀 흰자 라이소자임</td><td>Roche</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>헵탄</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>380539</td><td>28% NH3&nbsp; H2O에서, 두 배 증류법으로 순화하는 (집중하는?)</td></tr><tr><td>실험실 소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well plates&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>CELLSTAR 6-Well Plate</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>WTW</td><td>1AA110</td><td>Lab pH meter inoLab pH 7110</td></tr><tr><td>진공 및 여과 시스템</td><td>Nalgene</td><td>NALG300-4100</td><td>수신기 포함 필터 홀더, 유통업체 :</td></tr><tr><td></td> Yunus <td></td><td></td><td>및 동료 (ref 16)</td></tr><tr><td>PGSTAT30 Autolab</td><td>Metrohm Autolab</td><td></td><td>중단, Autolab PGSTAT302N</td></tr><tr><td>디지털 멀티미터 성공, METRAHit 22M</td><td>Gossen Metrawatt</td><td></td><td>중단, 후속 Metrahit Base</td></tr></tbody></table>

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

바이오 센서 병원 체 검출, 분자 진단, 환경 모니터링, 식품 안전 관리 등 다양 한 분야에서 점점 더 중요 하 고 구현 되 고 있다. 이러한 맥락에서 우리는 효율적인 기자 효소가 여러 단백질 단백질 상호 작용 연구로 β-lactamases를 사용. 또한, 강하게 펩 티 드 또는 구조적된 단백질/도메인의 삽입을 허용 하도록 그들의 능력 공상 단백질을 생성 하는이 효소의 사용을 권장 합니다. 최근 연구에서 우리 균 licheniformis BlaP β-lactamase에 단일 도메인 항 체 단편을 삽입. Nanobodies, 라고도 하는 이러한 작은 도메인 camelids에서 단일 체인 항 체의 항 원 묶는 도메인으로 정의 됩니다. 일반 이중 체인 항 체 처럼 그들은 높은 화력과 특이성 그들의 목표에 대 한 표시. 결과 공상 단백질 β-lactamase 활동을 유지 하면서 대상에 대 한 높은 선호도 전시. 이 nanobody 및 β-lactamase moieties 유지 기능 제안 합니다. 현재 작업에서 우리는 우리의 하이브리드 β-lactamase 시스템 바이오 센서 기술에 결합 하 여 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 특정 바인딩 대상에 nanobody의 효소의 촉매 활동 발표 양성자의 conductimetric 측정 덕분에 검색할 수 있습니다.

설계 및 엔지니어링의 공상 단백질 BlaP-택시-Lys3
그림 1 균 licheniformis에서 BalP 클래스 A β-lactamase의 관대 한 루프에 택시 Lys3의 삽입을 나타냅니다. 삽입은 잔류물 Asp198와 Lys199 사이 수행 되었다. 트 롬 빈 분열 사이트 택시-Lys3의 각 측면에 도입 되었다. BlaP-택시-Lys3 공상 단백질 인코딩 구성 식 플라스 미드와 변형 세포 암 피 실린의 작은 농도 면 전에 서 성장 할 수 있었다. 이 결과 하이브리드 β-lactamase 제대로 접혀, 수용 성 이다 그것은 효율적으로 암 피 실린에 대 한 저항을 제공할 수 있는 박테리아의 periplasmic 공간으로 성공적으로 배설 될 수 있음을 나타냅니다. 우리는 더욱 우리의 공상 단백질의 bifunctionality 분석. 우리의 이전 연구에서 ...

이 작품에서는, 우리는 하이브리드 β-lactamase 기술에 따라 conductimetric 바이오 센서를 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 새로운 방법을 보고 합니다. 이 메서드는 β-lactams의 가수분해 시 양성자의 출시에 의존합니다.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

본 전도성 바이오센서 분석의 전반적인 목적은 하이브리드 베타-락타마제 기술을 사용하여 생체 분자 간의 상호작용을 검출하는 것입니다. 본 논문에서는 키메라 베타-락타마제 단백질을 사용하여 항체-항원 상호작용을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 원리는 베타-락타마제 활성에 의한 양성자 방출을 측정하여 결합 여부를 검출하는 것입니다.이 기술이 기존 면역 센서보다 갖는 주요 장점은 키메라 베타-락타마제(beta-lactamase)를 사용한다는 점이며, 하이브리드 단백질을 이용해 분석물을 검출함으로써 더욱 저렴하고 빠른 센서 분석을 가능하게 합니다. 본 실험 절차는 대학원 연구원인 Mathieu Dondelinger가 시연합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 샘플 및 용액 준비 단계부터 시작하십시오. 웰당 300 microliters의 전극 준비 용액이 들어 있는 96-웰 플레이트의 웰에 전극 팁을 담그고, 실온에서 가볍게 섞어주며 2분 동안 유지하여 재사용 가능한 전극을 준비합니다.이 단계를 세 번 반복합니다. 그 후, 전극 팁을 웰당 300 microliters의 증류수가 들어 있는 96-웰 플레이트의 웰에 담그고 상온에서 부드럽게 섞으며 2분 동안 헹굽니다. 전극을 재생하려면, 전극 팁을 웰당 300 microliters의 재생 용액이 들어 있는 96-웰 플레이트의 웰에 담가 4 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 또는 상온에서 1시간 동안 둡니다.그런 다음, 웰당 300 µL의 인산염 완충 식염수가 담긴 96-웰 플레이트의 웰에 팁을 담가 전극을 3회 세척합니다. 각 세척은 실온에서 부드럽게 혼합하며 2분 동안 수행합니다. 인산염 완충액으로 준비한 40 µg/mL의 HEWL 15 µL 방울을 전극 표면에 적하하여 전극의 폴리아닐린 표면에 닭 달걀 흰자 리소자임을 코팅합니다.전극을 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 각 웰당 300 µL의 인산 완충액이 담긴 96-웰 플레이트의 웰에 센서 칩의 전극 부분을 담가 전극을 인산 완충액으로 3회 세척합니다. 각 세척 과정은 상온에서 부드럽게 혼합하며 2분 동안 수행합니다.전극 표면에 블로킹 용액 30 µL 한 방울을 떨어뜨려 전극을 포화시킵니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 이전과 동일하게 3회 세척합니다.BlaP-cAb-Lys3 또는 BlaP 용액을 결합 버퍼를 사용하여 20 micrograms per milliliter 농도로 희석합니다. 그 다음, 희석된 용액 15-microliter 한 방울을 전극 위에 도포합니다. 전극을 상온에서 1시간 동안 배양합니다.항원 나노바디 반응 후, 세척액으로 전극을 3회 세척합니다. 그런 다음, 웰당 300 µL의 검출 버퍼가 담긴 96-웰 플레이트의 웰에 전극을 담가 센서의 전극을 검출 버퍼로 세척합니다. 그리고 1분 동안 짧게 인큐베이션합니다.검출을 위해 디지털 멀티미터를 컴퓨터에 연결합니다. 그다음, 구리 회로 부분을 통해 센서 칩을 디지털 멀티미터에 연결합니다. 양전극(+) 표시가 된 전극 위에 4 mM benzylpenicillin 용액 50 µL 한 방울을 떨어뜨려 센서 반응을 유도합니다.음성 대조군으로 사용하기 위해 음성 표지 전극에 검출액 50 µL 한 방울을 떨어뜨립니다. 연결된 디지털 멀티미터로 30분 동안 전도도 값을 모니터링합니다. 데이터를 화면에서 실시간으로 시각화하거나, 디지털 데이터를 텍스트 파일로 내보냅니다.이 원시 데이터를 플롯하여 기준 전극과 샘플 전극 사이의 전도도 변화 측정값을 시간에 따라 나타내는 그래프 출력물을 생성할 수 있습니다. 키메라 단백질을 제작하기 위해, class A beta-lactamase BlaP를 운반체 단백질로 사용하였습니다. 여기서 촉매 잔기는 빨간색으로 표시되어 있습니다.용매 노출 루프(solvent-exposed loop)에 위치한 삽입 부위가 노란색으로 표시되어 있습니다. cAb-Lys3라고 명명된 낙타과 항체 단편이 BlaP에 삽입되었습니다. 그 결과 생성된 키메라 단백질인 BlaP-cAb-Lyse3는 베타-락타마제(beta-lactamase) 활성을 유지하면서 HEWL에 결합할 수 있습니다.BlaP-cAb-Lys3를 로딩하기 전, HEWL을 폴리아닐린이 코팅된 전극에 고정시켰습니다. 고정된 키메라 단백질에 의해 벤질페니실린이 가수분해될 때 양성자가 방출되며, 이로 인해 발생하는 전도성 변화를 사용자가 해석할 수 있습니다. 센서는 4개의 쌍으로 구성된 8개의 칩을 포함하고 있습니다.각 칩에는 폴리아닐린이 코팅된 작업 전극 1개, 기준 전극 1개, 상대 전극 1개 등 총 3개의 전극이 포함되어 있습니다. 각 쌍에서 음성(negative)으로 표시된 칩은 음성 대조군에 해당하며, 양성(positive)으로 표시된 칩은 테스트 샘플에 해당합니다. 여기에는 BlaP-cAb-Lys3와 HEWL의 특이적 상호작용을 나타내는 전도도 측정 결과가 제시되어 있습니다.전도도 변화는 고정화된 키메라 베타-락타마제(beta-lactamase)에 의한 항생제 가수분해로 유도된 양성자 방출로 인해 발생합니다. 음성 대조군인 천연 베타-락타마제 BlaP에서는 결합이 검출되지 않았습니다. 이 기술을 숙달하고 실험 조건이 최적화되어 적절하게 수행된다면, 반나절 만에 완료할 수 있습니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 BlaP에 항체 단편을 삽입하는 과정이 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 생성된 데이터의 품질이 키메라 베타-락타마제(beta-lactamase)의 기능성에 달려 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 검출된 상호작용을 정량화할 수 있는 다른 방법들을 수행하여 해당 상호작용의 평형 결합 상수를 결정할 수 있습니다.이 기술은 개발 이후, 면역 바이오센서 분야의 연구자들이 생물체부터 다양한 환경에 이르는 여러 시료 내의 분자 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 키메라 베타-락타마제 기술은 기본적으로 모든 항체나 단백질 단편을 기능화할 수 있는 다재다능한 도구이므로, 이 기술의 영향력은 수많은 생체 분자의 검출로 확대됩니다. 따라서 인간 및 동물의 건강과 같은 다양한 분야에서 저렴하고 빠른 진단 도구를 개발하는 데 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

이 비디오는 트랜스듀서 칩에 고정된 표적 항원과 항체의 상호 작용을 연구하기 위한 전도도 측정 바이오센서 분석을 보여줍니다. 바이오센서는 고정되지 않은 표적 항원에 결합하기 위해 나노바디에 융합된 기능적 촉매 부위가 있는 β-락타마제 효소인 이중 기능 키메라 단백질을 갖도록 설계되었습니다. 결합시 β-락타마제 효소에 의한 항생제 기질의 촉매 가수분해는 전기 신호를 생성하여 항원-항체 상호 작용을 확인합니다.

단백질-단백질 상호작용을 위한 β-Lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay

항생제에 취득한 저항은 중요한 공중 보건 문제이며 현재 인간의 삶에 가장 큰 위협의 하나로서 WHO에 의해 평가된다. 여기에 우리가 내성 박테리아를 약제에 대한 소설과 강력한 대리인의 발견에 중요한 항균 저항을 정량화하는 캔틸레버 기술의 사용을 설명합니다.

약물 타겟 상호 작용 및 항균 저항 검출 Nanomechanics

여기에 프로토콜은 바이오 층 간섭과 단백질 - 단백질 상호 작용의 운동 분석을 설명합니다. 셀룰러 에너지 대사에 관여 F 형 ATP 합성 효소는, 세균에서의 ε 서브 유닛에 의해 억제 될 수있다. 우리는 ε의 억제 C-말단 도메인과 촉매 복합체의 상호 작용을 연구하는 바이오 층 간섭을 채택했다.

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우리는 여기에 설명 친화력 네 일반적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 반응 속도를 결합 항체 - 항원의 측정을위한 프로토콜.

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

미세 바이오 센서 플랫폼 설계 및 다양 한 analytes의 신속 하 고 민감한 정량화에 대 한 낮은 비용 드라이 필름 포토 레지스트 기술을 사용 하 여 조작. 이 단일 사용 시스템 중지 흐름 기술에 의하여 효소 연결 된 분석 실험에-칩-움직일의 전기 판독을 허용합니다.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

여기, 선물이 커패시턴스 바이오 센서와 함께에서 각 인 분자를 사용 하 여 복잡 한 솔루션에서 검색 및 낮은 풍부한 분자의 정량화에 대 한 프로토콜.

분자 각 인을 사용 하 여 생체의 磁 검출 용량 성 바이오 센서 기반

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

이 논문에서는 스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계(BLI) 시스템을 사용하여 DNA-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 상호 작용의 평형 결합 친화도(KD)를 결정하기 위해 기본 또는 고급 결합 역학을 활용하기 위한 필수 단계와 고려 사항을 간략하게 설명합니다.

스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계를 사용한 DNA-단백질 상호작용 분석

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

배우세요 하이브리드 β-lactamase 기반 전도성 바이오센서 분석법을 이용하여 항체-항원 상호작용을 검출하는 방법을. 이 기술은 전통적인 면역센서보다 빠르고 경제적인 실시간 단백질 결합 분석을 가능하게 합니다.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

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