ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניתוח מולקולה בודדת של התפלגות קישורים צולבים בין-גדיליים מקומיים בלייזר ב-DNA גנומי על מנת לחקור תגובות תאיות לקישורים צולבים בין גדילי DNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, בנוגע להתפלגות נגעי ה-DNA שהוצגו על ידי טכנולוגיית לייזר, כלי ניסיוני בשימוש נרחב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה ישירה של נגעי DNA המוחדרים על ידי התרכובת המופעלת בלייזר ב- DNA הגנומי.

זה לא היה אפשרי בעבר. המדגימות את ההליך יהיו ג'וליה גיצ'ימו והימה גלי מהמעבדה שלנו. בכל פעם שמשתמשים בלייזר המטרה, חשוב לבצע כיול שקופיות מראה כדי לוודא שהלייזר פוגע בקואורדינטות XYZ המתאימות, ולקבוע את אזור השדה שצולם על ידי המצלמה שבו ניתן להגדיר את הלייזר לפגוע.

חפש בשקופית שדה שנחרט בעבר. הגדר את זמן החשיפה ואת עוצמת הלייזר. לאחר מכן כוונן את המיקוד כדי לעבור לשדה סמוך שאינו ממוקד בשקופית המראה.

התחל את הליך הכיול. התוכנה תירה את הלייזר כדי לחרוט את שקופית המראה לאורך קו אופקי ואלכסוני. קווים אלה מגדירים את גבולות השדה שבו הלייזר יכול לפגוע בתא מטרה.

הגדר מספר אזורי עניין, או ROIs, בתוך השדה וירה את הלייזר כדי לאשר שהוא מכוון לאזורים שנבחרו ובכך פוגע בקואורדינטות XYZ המתאימות. יש לבצע כיול ביולוגי גם בעת הגדרת מערכת הלייזר המכוונת למיקרוסקופ. הצעד הראשון הוא להגדיר את עוצמת הלייזר המינימלית הנדרשת כדי לבצע פוטו-אקטיבציה של trimethylpsoralen, או TMP, לגרום לקישורים צולבים בין-גדיליים ולעורר גיוס של גורם תיקון מתויג GFP, שעבורו ניתן לאפיין בעבר קינטיקה.

במעבדה זו נעשה שימוש בקו תאים U2OS שהועבר ביציבות עם מאוורר GFP המבטא פלסמיד. כפי שמוצג כאן, כאשר תאים נחשפים לשישה TMP מיקרו-מולרי ו-1.2% לייזר תמונה למשך 10 דקות, צפייה ברצף התמונות כסרטון מאשרת את הגיוס של מאוורר GFP אחד להחזר ה-ROI הממוקד. השלב השני הוא לוודא שהגדרת כוח זו אינה מפעילה גיוס בהיעדר התרכובת.

כפי שמוצג כאן, כאשר תאים נחשפים לתמונה של 1.2% לייזר בלבד למשך 10 דקות והתמונה נצפית כסרטון, אין גיוס של מאוורר GFP אחד להחזר ההשקעה הממוקד. שלישית, חשוב להגדיר את הגדרת ההספק המינימלית המסוגלת לפוצץ תא. יש לבדוק את היכולת לפוצץ תא בהגדרת הספק זו ככיול ביולוגי שגרתי בכל יום שבו משתמשים בלייזר המטרה.

הגדר את ההחזר על ההשקעה בתוך הגרעין תוך הימנעות מהגרעינים. כוונן את המיקוד. הגדר את עוצמת הלייזר ל-12% וירה.

לבסוף, חיוני להגדיר את מישור המוקד באמצע התא כדי להשיג מיקוד נכון. כדי להדגים זאת, שלושה תאים מכוונים לשלושה מישורי מוקד. תא אמצעי.

גבוה מדי. ונמוך מדי. שלוש דקות לאחר המיקוד, נוצרת ערימת תמונות המשתרעת על פני שלושה מיקרון כדי לבחון את התפלגות מאוורר ה-GFP, פס אחד בכל מישור המוקד המצולם.

רק התא המכוון לתא האמצעי מראה מאוורר GFP פס אחד בכל מישורי Z. לפני ביצוע לוקליזציה בלייזר הכינו כלי תרבית תאים תחתון זכוכית 35 מילימטר לגידול תאים. בעזרת עט סימון סימן אנכי בצד כל מנה.

השתמש בעט יהלום כדי לגרד צלב במרכז הזכוכית על משטח התרבית, כך שהפס השחור בצד הכלי נמצא בחלק העליון של זרוע אחת של הצלב. הצלב מסומן על משטח הגידול של הזכוכית כך שהוא והתאים יהיו באותו מישור מוקד. תאי צלחת ומעוקרים סימנו צלחות תרבית ודגירה למשך 24 שעות במיקרו-מולרית אחת חמש כלורו דאוקסיורידין כדי לסמן DNA באופן אחיד.

ביום הניסוי, הוסף TMP המקושר לדיגוקסיגנין או חפור TMP באתנול 50% למדיום תרבית התאים לריכוז סופי של 20 מיקרומולר. מביאים את המדיום ל -37 מעלות צלזיוס. החלף את המדיום בכלי התרבות ב-dig TMP המכיל מדיום ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-Dig TMP להתאזן.

בזמן הדגירה של התאים בצע כיול שקופיות מראה ונשיפה של 12% מהתא כפי שהודגם קודם לכן. הנח את הצלחת בתא הסביבתי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם CO2 ולחות מבוקרים על במת המיקרוסקופ. התמקד עם מטרת השמן פי 60 בצומת הצלב.

בחר את השדה הראשון למיקוד והשתמש בכלי הצורה כדי להגדיר את ההחזר על ההשקעה בתאים בודדים הממוקמים בסביבה הקרובה של צומת הצלב. בחר אזורים נוקלאופלזמיים מחוץ לגרעינים. כוונן את מישור המוקד Z כדי למקד את הלייזר באמצע הדרך דרך הגרעינים.

לאחר מכן, הגדר את הגדרת ההספק למינימום הנדרש כדי להפעיל את הפסורלן בתגובת נזק ה-DNA המושרה על ידי קישור צולב בין-גדילי. 1.2% משמש כאן. הפעל את הלייזר.

לאחר שכל התאים בשדה סומנו, הזיזו את הלוח לשדה חדש, והישארו קרובים לצומת הצלב. חזור על ההליך שהודגם זה עתה ב-12 עד 18 שדות כדי להתמקד בסך הכל ב-80 עד 100 תאים. כדי לקצור את התאים, הסר את צלחת התרבות מהבמה.

הסר את המדיום ושטוף את התאים בתמיסת PBS. הסר את ה-PBS והניח טיפה של 10 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין EDTA מסחרית על צומת הצלב באמצע משטח הזכוכית. דגרו במשך שלוש עד ארבע דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן משכו את תמיסת הטריפסין עם תאים מנותקים לקצה פיפטה.

הנח את טיפת הטריפסין EDTA עם התאים בקצה אחד של שקופית מיקרוסקופ זכוכית סילנית. כדי לשחרר את התאים ולשחרר את הדנ"א, יש להוסיף 10 מיקרוליטר של תמיסת SDS של 5% ולדגור במשך שלוש עד ארבע דקות בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב עדין עם קצה הפיפטה, מה שמאפשר לפריפריה של הבריכה להתייבש. הטה את השקופית 20 מעלות ואפשר לנוזל לזרום עד הסוף.

הכוחות ההידרודינמיים של הנוזל הזורם יאריכו וימתחו את סיבי ה-DNA. תן למגלשה להתייבש באוויר במשך 10 דקות. טבלו את השקופית בתמיסה של שלושה עד אחד מתנול לחומצה אצטית וקבעו למשך 10 דקות.

לאחר מכן הסר את השקופית מתמיסת התיקון וייבש שוב באוויר. בשלב זה ניתן לאחסן את המגלשה ללא הגבלת זמן ב-70% אתנול ב-20 מעלות צלזיוס. כדי לעבד את השקופית לזיהוי אותות חפירה על סיבי DNA על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הסר את השקופית עם ה-DNA המתוח מתמיסת האתנול של 70% ואפשר לה להתייבש באוויר.

לאחר מכן יש לפרק את סיבי ה-DNA במימן כלורי ולאחר מכן להעביר אותם למיכל של tris hydrochloridic ב-PH 8 לנטרול. לאחר מכן שטפו את הדגימות ב- PBS. ולבסוף, הכתים אותם בנוגדנים המתאימים בעקבות הליך שפורסם בעבר.

מוצג המבנה של trimethylpsoralen עם תג dioxigenin. ניתן להציג קישורים צולבים של DNA בין-גדילי, או ICL, על ידי תפרחת חיסונית כנגד חפירת TMP. דוגמה זו מציגה תאים עם הצטברות של סמן ידוע היטב של תגובת נזק ה-DNA גמא H2AX, המוצג בירוק, ב-ROIs המכילים ICLs מקומיים בלייזר המומחשים באדום.

הגרעין המוכתם ב-DAPI הוא בכחול. השדה הבהיר מראה תא בחלקו על הסימן שיצר עט היהלום. שימו לב שהחזר ROI ממוקם מחוץ לגרעינים.

כדי לקבוע את התדירות והמרווח של התוספות, התאים הודגרו בחמישה כלורו דאוקסיורידין במשך 24 שעות לפני הכנסת ה-ICL. לאחר קצירת התאים והפצת סיבי ה-DNA, אותות החפירה זוהו עם נקודה אמינו קוונטית המומחשת באדום בחמשת הכלורו דאוקסיורידין על ידי תפרחת אמינו המומחשת בירוק. ניתוח אותות החפירה על הסיבים מעלה כי המרחקים בין ICL נעים בין פחות מ-10 KB ליותר מ-160 KB. לא היו עדויות לתוספות מקובצות.

בעקבות הנחיות אלה אמור להיות אפשרי להרחיב גישה זו לתוספות DNA אחרות, כגון נגעים חמצוניים שניתן למקם על ידי לייזרים באורך גל מתאים.