Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Bu prosedürün genel amacı, DNA zincirler arası çapraz bağlara hücresel tepkileri incelemek için genomik DNA'daki lazer lokalize zincirler arası çapraz bağların dağılımının tek molekül analizini yapmaktır. Bu yöntem, yaygın olarak kullanılan bir deneysel araç olan lazer teknolojisi tarafından tanıtılan DNA lezyonlarının dağılımı ile ilgili DNA onarım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genomik DNA'da lazerle aktive edilen bileşik tarafından sokulan DNA lezyonlarının doğrudan görüntülenmesine izin vermesidir.

Bu daha önce mümkün değildi. Prosedürü göstermek için laboratuvarımızdan Julia Gichimu ve Hima Gali olacak. Hedefleme lazeri her kullanıldığında, lazerin uygun XYZ koordinatlarında isabet ettiğini doğrulamak ve lazerin isabet etmek üzere ayarlanabileceği kamera tarafından yakalanan alan alanını belirlemek için bir ayna kızağı kalibrasyonu yapmak önemlidir.

Slaytta daha önce kazınmış bir alan bulun. Pozlama süresini ve lazer gücünü ayarlayın. Ardından, ayna slaytında hedeflenmemiş yakındaki bir alana geçmek için odağı ayarlayın.

Kalibrasyon prosedürünü başlatın. Yazılım, ayna sürgüsünü yatay ve çapraz çizgi boyunca aşındırmak için lazeri ateşleyecektir. Bu çizgiler, lazerin bir hedef hücreyi vurabileceği alanın sınırlarını tanımlar.

Alanın içinde birkaç ilgi alanı veya ROI ayarlayın ve seçilen alanları hedeflediğini doğrulamak ve böylece uygun XYZ koordinatlarına vurmak için lazeri ateşleyin. Mikroskop hedefleme lazer sistemi kurulurken biyolojik bir kalibrasyon da yapılmalıdır. İlk adım, trimetilpsoralen veya TMP'yi fotoaktive etmek, iplikler arası çapraz bağları indüklemek ve kinetiğin daha önce karakterize edilebildiği GFP etiketli bir onarım faktörünün işe alınmasını teşvik etmek için gereken minimum lazer gücünü tanımlamaktır.

Bu laboratuvarda, GFP fanı olan bir plazmid ile stabil bir şekilde transfaset edilmiş bir U2OS hücre hattı kullanılmaktadır. Burada gösterildiği gibi, hücreler 10 dakika boyunca altı mikromolar TMP'ye ve% 1.2 lazere maruz kaldığında, görüntü dizisini bir video olarak görüntülemek, GFP fan one'ın hedeflenen yatırım getirisi için işe alındığını doğrular. İkinci adım, bu güç ayarının bileşiğin yokluğunda işe alımları tetiklemediğini doğrulamaktır.

Burada gösterildiği gibi, hücreler 10 dakika boyunca tek başına %1,2 lazer görüntüsüne maruz kaldığında ve görüntü bir video olarak görüntülendiğinde, hedeflenen yatırım getirisi için GFP fan one'ın işe alınması söz konusu değildir. Üçüncüsü, bir hücreyi patlatabilecek minimum güç ayarını tanımlamak önemlidir. Bu güç ayarında bir hücreyi patlatma yeteneği, hedefleme lazerinin kullanıldığı her gün rutin bir biyolojik kalibrasyon olarak test edilmelidir.

Nükleollerden kaçınırken yatırım getirisini çekirdeğin içine ayarlayın. Odağı ayarlayın. Lazer gücünü %12'ye ayarlayın ve ateşleyin.

Son olarak, doğru hedeflemeyi elde etmek için odak düzlemini orta hücreye ayarlamak önemlidir. Bunu göstermek için, üç hücre üç odak düzleminde hedeflenir. Orta hücre.

Çok yüksek. Ve çok düşük. Hedeflemeden üç dakika sonra, GFP fanının görüntülenen odak düzlemi boyunca bir şerit olacak şekilde dağılımını incelemek için üç mikron uzunluğunda bir görüntü yığını oluşturulur.

Yalnızca orta hücreyi hedefleyen hücre, tüm Z düzlemlerinde bir şerit olan bir GFP fanı gösterir. Lazer lokalizasyonunu gerçekleştirmeden önce, büyüyen hücreler için 35 milimetrelik bir cam tabanlı hücre kültürü kapları hazırlayın. Bir işaretleme kalemi ile her yemeğin yan tarafında dikey bir işaret yapın.

Kültür yüzeyinde camın ortasına bir çarpı işareti çizmek için elmas bir kalem kullanın, öyle ki tabağın yan tarafındaki siyah şerit haçın bir kolunun üstünde olacak. Haç, camın büyüme yüzeyinde işaretlenir, böylece cam ve hücreler aynı odak düzleminde olacaktır. Plaka hücreleri ve sterilize edilmiş çapraz işaretli kültür kapları ve DNA'yı düzgün bir şekilde etiketlemek için bir mikromolar beş kloro deoksiüridin içinde 24 saat inkübe edin.

Deney gününde, hücre kültürü ortamına 20 mikromolar nihai konsantrasyona kadar digoksigenin bağlantılı TMP ekleyin veya %50 etanol içinde TMP kazın. Ortamı 37 santigrat dereceye getirin. Kültür kaplarındaki ortamı, ortam içeren dig TMP ile değiştirin ve kazma TMP'sinin dengelenmesine izin vermek için 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin.

Hücreler inkübe edilirken, ayna lam kalibrasyonu yapın ve daha önce gösterildiği gibi bir hücreden %12 üfleyin. Plakayı, mikroskop sahnesinde kontrollü CO2 ve nem ile 37 santigrat derecede çevre odasına yerleştirin. 60X yağ objektifi ile haçın kesişme noktasına odaklanın.

Hedeflenecek ilk alanı seçin ve çarpı işaretinin kesişiminin hemen yakınında bulunan tek tek hücrelerde ROI'leri ayarlamak için şekil aracını kullanın. Nükleollerin dışındaki nükleoplazmik alanları seçin. Z odak düzlemini, lazeri çekirdeğin ortasına kadar hedefleyecek şekilde ayarlayın.

Daha sonra, iplikçikler arası çapraz bağ ile indüklenen DNA hasar yanıtında psoralen'i aktive etmek için gereken minimum değere güç ayarını ayarlayın. Burada %1.2 kullanılır. Lazeri ateşleyin.

Bir alandaki tüm hücreler hedeflendikten sonra, plakayı çarpı işaretinin kesişme noktasına yakın kalacak şekilde yeni bir alana taşıyın. Toplam 80 ila 100 hücreyi hedeflemek için az önce 12 ila 18 alanda gösterilen prosedürü tekrarlayın. Hücreleri hasat etmek için kültür kabını sahneden çıkarın.

Ortamı çıkarın ve hücreleri PBS solüsyonu ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve cam yüzeyin ortasındaki haçın kesişme noktasına 10 mikrolitrelik bir ticari tripsin EDTA çözeltisi damlatın. Oda sıcaklığında üç ila dört dakika inkübe edin ve ardından tripsin çözeltisini ayrılmış hücrelerle bir pipet ucuna çekin.

Tripsin EDTA damlasını, silanize cam mikroskop lamının bir ucuna hücrelerle birlikte yerleştirin. Hücreleri parçalamak ve DNA'yı serbest bırakmak için 10 mikrolitre% 5 SDS çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında üç ila dört dakika inkübe edin, pipet ucuyla hafifçe karıştırın ve havuzun çevresinin kurumasını bekleyin. Sürgüyü 20 derece eğin ve sıvının sonuna kadar akmasına izin verin.

Akan sıvının hidrodinamik kuvvetleri, DNA liflerini uzatacak ve gerecektir. Slaytın 10 dakika kurumasını bekleyin. Slaytı asetik aside üç ila bir metanol çözeltisine batırın ve 10 dakika sabitleyin.

Ardından slaytı sabitleme solüsyonundan çıkarın ve tekrar havayla kurutun. Bu noktada, slayt 20 santigrat derecede% 70 etanol içinde süresiz olarak saklanabilir. Floresan mikroskobu ile DNA lifleri üzerindeki kazma sinyallerinin tespiti için slaydı işlemek için, gerilmiş DNA ile slaytı %70 etanol çözeltisinden çıkarın ve havada kurumaya bırakın.

Daha sonra, DNA liflerini hidrojen klorür içinde denatüre edin ve daha sonra nötralizasyon için PH sekizde bir tris hidrokloridik kabına aktarın. Daha sonra numuneleri PBS'de yıkayın. Ve son olarak, daha önce yayınlanmış bir prosedürü izleyerek bunları uygun antikorlarla boyayın.

Bir dioksigenin etiketine sahip trimetilpsoralen'in yapısı gösterilmiştir. İnplİNCLER arası DNA çapraz bağları veya ICL'ler, dig TMP'ye karşı immünofloresan ile görüntülenebilir. Bu örnek, kırmızı ile görselleştirilmiş lazer lokalize ICL'leri içeren ROI'lerde, yeşil renkle görselleştirilen DNA hasar yanıtı gama H2AX'in iyi bilinen bir markörü birikimine sahip hücreleri göstermektedir.

DAPI lekeli çekirdek mavi renktedir. Parlak alan, kısmen elmas kalem tarafından yapılan işaretin üzerinde bir hücreyi gösterir. ROI'lerin nükleollerin dışına yerleştirildiğini unutmayın.

Eklentilerin sıklığını ve aralığını belirlemek için, hücreler ICL'lerin yerleştirilmesinden 24 saat önce beş kloro deoksiüridin içinde inkübe edildi. Hücrelerin toplanmasından ve DNA liflerinin yayılmasından sonra, kazma sinyalleri, yeşil renkte görüntülenen amino floresan ile beş kloro deoksiüridin içinde kırmızı renkte görüntülenen bir amino kuantum noktası ile tespit edildi. Fiberler üzerindeki kazma sinyallerinin analizi, ICL'ler arası mesafelerin 10 KB'den az ile 160 KB'den büyük arasında değiştiğini ortaya koymaktadır. Kümelenmiş eklentiler için kanıt yoktu.

Bu yönergeleri izleyerek, bu yaklaşımı, uygun dalga boyuna sahip lazerler tarafından lokalize edilebilen oksidatif lezyonlar gibi diğer DNA eklentilerine genişletmek mümkün olmalıdır.