用于蜂蜜蜜蜂筛选化学成分的视频跟踪协议

该程序的总体目标是评估蜜蜂的化学威慑剂。这种方法可以帮助回答昆虫学领域的关键问题，例如哪些化学物质会纵蜜蜂远离食物来源的行为。该协议的主要优点是它提供了一种简单的方法，以相对快速和简单的方式筛选蜜蜂的化学威慑剂。

为了制备用于对照处理的糖 - 琼脂糖块，将半冷却的糖 - 琼脂糖溶液倒入称重船模具中。对于驱虫处理，将所需量的化合物添加到半冷却的琼脂糖溶液中。在本演示中，使用 1% DEET 的最终浓度。

旋转烧瓶以混合化合物，然后将溶液倒入称重船模具中。糖琼脂糖块冷却后，从称重船模具中取出凝固的立方体，然后用湿纸巾将它们放入塑料容器中。将容器放入冰箱存放。

在跟踪软件中，导航到位于屏幕左侧的实验资源管理器栏中的实验设置。确保选择了正确的摄像机，并且视频录制以培养皿竞技场为中心。如果需要将视频录制居中，请进入摄像机的设置，在感兴趣区域控件下，然后选择 中心 X 和 中心 Y 选项。

在 experiment settings （实验设置） 下，将竞技场数更改为 16。在追踪要素下，选择中心点检测。然后选择竞技场设置以设置分析所需的竞技场。

将 16 个培养皿以 4 x 4 的模式放置在位于相机下方的灯箱顶部。在竞技场设置中，使用位于右侧工具面板上的抓取背景按钮拍摄 16 个培养皿的照片。这将用作设置 arena 的模板。

从竞技场设置屏幕顶部的工具栏中选择 create ellipse（创建椭圆），然后创建一个与抓取图像中其中一个培养皿的直径匹配的圆圈。将 arena 一个标记放入圆圈中。然后选择区域组 1，位于右侧工具面板中的 arena one 下。

从屏幕顶部的工具栏中选择 create rectangle。使用此工具创建一个 30 x 30 像素的正方形。然后将其放置在上一步中创建的圆的中心。

从顶部工具栏中选择 add zone，然后单击正方形的中间。将区域移动一个标记，使其位于正方形中。接下来，在右侧工具面板中选择 arena one，然后单击 duplicate complete arena.

从下拉菜单中，选择所有其他竞技场，然后单击 OK（确定）。将复制的 Arena 设置移动到抓取图像中剩余的培养皿。然后选择 arena one 并选择顶部工具栏上的 calibrate scale。在竞技场一培养皿的直径上绘制校准线。

将直径测量值更改为 9 厘米。在右侧工具面板上选择 validate arena settings（验证竞技场设置）。接下来，在左侧的控制栏上选择检测设置。

选择 检测设置 1，然后在右侧工具箱的下拉菜单中选择 灰度缩放。在 detection （检测） 下，设置范围，使其为 0 到 83。右键单击 Detection Settings（检测设置），然后创建名为 Detection Settings Two 的新设置。

确保灰度仍处于选中状态，但不要更改其他参数。在实验资源管理器中选择 Trial list，然后单击顶部工具栏中的 add variable。将用户定义的变量命名为 Treatment。

在 user defined treatment 列中选择 predefined values 下拉栏，并将 control 和 treatment 添加为预定义值。单击位于顶部工具栏的 add trials 按钮，然后添加两个 trial。然后对于每个竞技场，选择它是控制竞技场还是治疗竞技场。

接下来，在实验资源管理器面板下选择 data profile。在左侧列中，选择 treatment （处理），位于 User defined independent variables （用户定义的自变量） 标题下。这会在包含流程图的区域中添加一个筛选框。

在弹出框中选择 C，然后将新创建的过滤器放在开始框和结果框之间。流程图箭头应进行调整，以便它们从开始框指向筛选器，最后指向结果框。重复此步骤，但这次，选择 T 作为过滤器，然后选择 result 在下面 common elements 部分。

将新创建的框移动到流程图区域，并用箭头连接框，保存文件。启动可视化跟踪程序并打开为此分析创建的已保存实验文件。选择检测设置 2。

然后将对照糖琼脂糖块放入 16 个培养皿中的 8 个培养皿的中心。对其余八个培养皿中的糖 - 琼脂糖复合块重复此过程。用镊子从塑料盒中取出一只蜜蜂，并将其放入对照培养皿之一中。

对其余 15 个培养皿重复此步骤。将所有盘子放在灯箱上。通过设置为红色光谱的 LED 灯阵列从下方照亮灯箱，并放置它们，使竞技场检测区域适合每个培养皿竞技场。

用黑色塑料板包围整个盒子和相机，以消除外部光线并减少竞技场内的阴影。设置培养皿后，确保检测设置 1 是所选设置。此时，视觉跟踪软件应该只捕捉培养皿竞技场内的蜜蜂。

然后从实验资源管理器中选择 acquisition 。按右侧采集控制弹出框中的绿色开始试用按钮开始录制。运行分析结果 10 分钟，然后单击采集对照弹出框上的红色停止试验按钮以停止记录。

此处显示了 DEET 对个体蜜蜂摄食行为影响的代表性结果。暴露于对照立方体的个体在喂食区平均花费 343 秒，而暴露于含有 DEET 的立方体的个体为 16 秒。这里显示了两种不同化合物对单个蜜蜂摄食行为影响的代表性结果。

暴露于非威慑性化合物的个体在摄食区平均花费 282 秒，而对照组在那里花费约 352 秒。暴露于威慑性化合物会导致个体在摄食区花费的时间明显减少，约为 23 秒。与在该区域平均花费 493 秒的控制相比。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 20 分钟内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住提前准备好所有东西，并让蜜蜂饿着足够的时间。观看此视频后，您应该对如何使用视频跟踪软件确定注入食物源的化合物对单个蜜蜂的影响有很好的了解。

按照此程序，可以执行其他方法，如近场和场测定，以回答有关化合物在菌落水平上的影响的其他问题。开发后，这项技术为昆虫学领域的研究人员探索新型化学成分及其对蜜蜂摄食行为的影响铺平了道路。不要忘记，使用化合物可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备。