Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Bu prosedürün genel amacı, nefron yaralanmasını ve onarımını modellemek için Zebra balığı böbrek epitel hücrelerinin hedefli ablasyonunu indüklemektir. Bu yöntem, organ ve özellikle böbrek rejenerasyonu alanındaki önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, rejenerasyonda yer alan ana hücresel süreçler nelerdir, hayatta kalan dokuların plastisitesinin kapsamı nedir ve daha pek çok şey.

Bu tekniğin temel avantajı, yaralanmanın hassas mekansal zamansal kontrolüne ve ayrıca yaralanma seviyesini ayarlama yeteneğine izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri, akut böbrek hasarının tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü böbrek hücresi hasarı ve rejenerasyonunda yer alan hücresel ve moleküler süreçlerin kesin mekansal ve zamansal değerlendirmesine izin verir. Başlamak için, böbrek GFP floresan Zebra Balığı'nı geçerek embriyolar oluşturun.

Döllenmeyi takip eden 24 saat boyunca embriyoları 28.5 santigrat derecede E3 solüsyonunda tutun. Ardından, E3 ortamını değiştirmek için E3'te %0,003 PTU kullanın. Embriyoları altı veya daha fazla gün boyunca inkübatöre geri koyun, bu noktada böbrekler olgunlaşmış olacaktır.

Zebra balığını canlı görüntüleme için haritalamak için, mililitre trigain çözeltisi başına 0,2 miligram ile %1 ila %2 arasında düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Bir embriyoyu solüsyona aktarmak için plastik veya cam pipet kullanmadan önce agaroz trigain solüsyonunun soğuk olduğundan emin olun. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanarak, larvaları agarozun içine çekin ve 35 milimetrelik bir tabağın ortasına koyun.

Tabağın altını eşit şekilde kaplayacak şekilde Zebra Balığı içeren agarozu hızla yayın. Daha sonra larvaları foto ablasyon ve görüntüleme için yönlendirmek için bir cam prob kullanın, böylece ilgilenilen böbrek segmenti ışın yoluna dik olurken, kontra lateral segment lazer ışınından uzakta olur. Zebra balığının oryantasyonu, lazer ablasyonunu içeren ilerleyen adımlar için çok önemlidir.

Larvaların agarozda dik bir pozisyonda kalmasını sağlamak için iyi bir teknik tavsiye edilir. Buharlaşmayı en aza indirmek için Petri kabını örtün ve agarozun yaklaşık 15 dakika katılaşmasına izin verin. Konfokal mikroskobu kurduktan sonra, metin protokolüne göre, dik konfigürasyonda, larvaları içeren Petri kabını bir mikroskop lamının üzerine yerleştirin ve yerinde tutmak için modelleme kili kullanın.

Ardından, kayar Petri kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, üç mililitre görüntüleme solüsyonu ekleyin. Suya daldırma merceğinin altında, havanın ışın yolunda sıkışmasını önlemek için merceğin hafif açılı olduğundan emin olarak sahneyi yavaşça kaldırın.

Lens çözeltiye belirli bir açıyla dokunduğunda, embriyonun görüş alanında olacak şekilde ortalayın. Şimdi, floresan ışık kaynağını kullanarak, ilgilenilen segmenti bulun, ardından yaralanmayı hedeflemek için yüzeysel dala odaklanın. Işık saçılımını en aza indirmek için seçilen yüzeysel dallar.

Mikroskop yazılımında, görünüm, alım kontrolü, C2plus kompakt GUI'ye gidin. Piksel bekleme süresini 1,9 mikrosaniye, kare boyutunu 512 x 512 piksel ve iğne deliği boyutunu 90 mikron olarak ayarlayın. 405 nanometre lazer yoğunluğunu sıfıra ve 488 lazer yoğunluğunu düşük bir değere ayarlayın.

488 nanometre lazeri kullanırken, yazılım arayüzünde tara'ya tıklayın. Işın yoluna dik olan ve iyi GFP floresansı ile iyi bir şekilde görselleştirilen ilgilenilen segmenti bulun. Bu bölge belirlendikten sonra, bir ilgi alanı çizmek için ROI'ye gidin, eliptik ROI çizin.

Ardından, görünüme, edinme kontrollerine, C2plus tarama alanına gidin ve bant tarama alanını seçin, dikdörtgen maske bu arayüzde görünecektir. İmleci kullanarak, lazer ablasyon için hedeflenen segmenti kapsayacak şekilde manuel olarak dikdörtgen bir tarama tanımlayın. Seçimi kabul etmek için maske alanının içini sağ tıklatın.

GFP'yi etkinleştirmek için sadece 488 nanometre lazeri kullanarak, yeşil kanalı izlerken zaman ölçümüne başlayın. 488 lazerin yoğunluğunun nispeten düşük olduğundan emin olun. Ölçüm, zaman ölçümü seçerek ilgilenilen bölgedeki GFP'nin ortalama yoğunluğunu ölçün.

ROI içindeki ortalama yoğunluk seviyelerini izlemek için grafiği veya veri sekmesini kullanın. Menekşe lazeri kullanarak, lazer güç kontrolünü tamamen sağa kaydırarak yoğunluğu% 100'e çıkararak böbrek hücrelerine zarar verin. Grafik sekmesinde, bir çizgi grafiğini gözlemleyin veya GFP yoğunluğunun sayısal değerlerini gözlemlemek için veri sekmesini kullanın ve istenen seviyeye düşene kadar bekleyin.

Örneğin, taban çizgisinin %50'si. Eliptik ROI içindeki GFP yoğunluğu istenen seviyeye düştüğünde, lazer güç kaydırıcısını tamamen sola hareket ettirerek yazılım kontrol panelinde mor lazerin yoğunluğunu hemen sıfıra düşürün. Son olarak, yeni bir GFP floresan taban çizgisi elde edin.

Bu şekilde gösterildiği gibi, 405 nanometre lazer ışığına maruz kaldıktan sonra, GFP floresansı her seferinde bir hücre kaybolmaya devam eder. 220. dakikaya kadar, tüm ablate segmenti GFP pozitifliğinin %100'ünü kaybeder. Bu, GFP pozitifliğini kaybeden hücrelerde kırmızı floresan propidyum iyodür pozitif çekirdeklerin ortaya çıkmasıyla görüldüğü gibi, GFP ekspresyonunun aşağı regülasyonundan değil, hücre ölümünden kaynaklanır.

Bu görüntüler, ilk maruziyeti değiştirerek, yaralanmayı ve yaralı epitele verilen yanıtı çevirmenin mümkün olduğunu göstermektedir. %10 ila %20 başlangıç GFP foto ağartma ile, yaralanmadan beş saat sonra GFP pozitifliğinde neredeyse hiç azalma gözlenmez. %50 ve %60'ı beş saat içinde GFP'nin tamamen kaybolmasına yol açarken, %30 ve %40 ağartma, yaklaşık %35'lik foto ağartmada gözlenen %50 tahmini ölüm ile ara sonuçlara yol açar.

Bu, %20 foto ağartmanın ablasyondan 100 dakika sonra neredeyse hiç propidyum iyodür boyaması ile sonuçlanmadığı propidyum iyodür boyama ile desteklenir. Ancak %50 foto beyazlatma 60 dakika sonra ablasyonlu epitelde sürekli propidyum iyodür pozitifliğine yol açar. %30 ve %40 foto ağartma ise ara propidyum iyodür katılımına yol açar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir. Lazerler ve kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken lazer ışınına bakmaktan kaçınmak ve kimyasalları tutarken eldiven kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, böbrek hasarını diseksiyon ve hücresel ve moleküler düzeyde onarmayı amaçlayan ek soruları yanıtlamak için hızlandırılmış mikroskopi, immünofloresan boyama ve diğerleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirildikten sonra bu teknik, böbrek rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların önünü açtı. Zebra balıklarında yaralanma sonrası toplu hücre göçü ve böbrek onarımının rolünü keşfetmek. Bu videoyu izledikten sonra, GPF transgenik Zebra balığı larvalarında ve embriyolarında belirli böbrek segmentlerine zarar vermek için konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.