Name: 共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学ぶF-アクチンへのタンパク質結合の測定法。共沈降アッセイを用いて結合親和性を定量化し、細胞骨格タンパク質の相互作用を解析する実験手法です。超遠心分離機を使用します。

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この研究は、国立衛生研究所認可HL127711のAVKに支持された。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

アクチン共沈降アッセイは、タンパク質がF-アクチンに結合するかどうかを迅速に判定することができる簡単な技術である。いくつかの変更を加えて、この技術を用いて相互作用の親和性を測定することもできる。上記のプロトコールで提起された点に加えて、アッセイの設計、実施および解釈の際には、以下の問題を考慮する必要があります。 関心のあるタンパク質新たに調製または凍結したタンパク質をアッセイに使用することができる。凍結タンパク質が使用される場合、凍結がF-アクチン結合に影響を及ぼさないように、結果を新鮮な（決して凍結されていない）タンパク質と比較することが強く推奨される。 G-アクチン源多くのペレット化実験は、その豊富な存在のために筋肉から単離されたG-アクチンを使用する。哺乳動物には、α、β、γの3つの主要なアクチンアイソタイプがあり、それらは非常に類似している（&gt; 90％の配列同一性ty）。それにもかかわらず、アイソタイプ12,13の間に機能的な相違がある。可能であれば、結合アッセイに使用されるG-アクチンアイソタイプは、インビボアイソタイプと一致するはずである。例えば、骨格筋で発現されるタンパク質を試験する場合、α-アクチンが最良の選択である。線維芽細胞で発現されるタンパク質を調べる場合は、β-アクチンが推奨される。 ファロイジン使用ファロイジンはFアクチンに結合するので、Fアクチン結合タンパク質（アクチンフィラメントへの結合からのコフィリンなどのファロイジンブロック）の結合を妨害したり、ブロックすることさえあります14 。従って、ファロイジンは注意して使用すべきであり、可能であれば非ファロイジン処理した試料と比較した。 高い背景 F-アクチンの非存在下でタンパク質が沈降することは珍しいことではない（ 図1A 、F-アクチンペレット試料なしs）。しかしながら、高いレベルのバックグラウンド沈降は、真のアクチン共沈降を隠し、不可能ではないにしても、タンパク質がF-アクチンに結合するか、または相互作用の親和性を測定するのを困難にする可能性がある。ポリジカノールを反応緩衝液（工程4.1）に添加することにより、バックグラウンドを有意に減少させることができ、容易な解決策である。それがバックグラウンドを減少させないならば、反応緩衝液、塩濃度、および/またはインキュベーション温度を調整することが役立ち得る。 結合曲線結合曲線を生成するためには、目的のタンパク質またはF-アクチンの濃度を一連の反応にわたって変化させることが必要である。実際には、固定された濃度でF-アクチンを維持し、目的のタンパク質の濃度を変化させることがより容易で好ましい。ペレット化アッセイにおいて固定濃度（ 例えば、 2μM）でF-アクチンを維持することにより、より高い濃度のF-アクチンでの非特異的捕捉が制限され、より低い（&lt;0.5μM）濃度のF-アクチンでの解重合。脱重合はファロイジンを用いて防止することができるが、これは系に潜在的な複雑化因子を導入する（工程3.3以上参照）。固定濃度でF-アクチンを維持することにより、サンプル間でF-アクチンペレットを比較（および標準化）することができ、失敗した実験（ すなわち、 F-アクチンペレットが非常に変動し、濃度間の分析を妨げる）を同定することができる。最後に、固定濃度でF-アクチンを維持することにより、アクチンフィラメントへの結合が協同的であるかどうかを決定することができる（ 図1C ）。 飽和結合すべての結合実験と同様に、F-アクチンへの結合が飽和し、タンパク質+ F-アクチンの濃度が安定することが重要です（ 図1C ）。プラトーがなければ、正確な解離平衡定数を計算することはできません。したがって、それ試験すべき希釈シリーズを注意深く計画し、常により高濃度のタンパク質（ すなわち、予想されるK dよりも少なくとも5〜10倍高い）を含むことが重要である。 バインディング分析測定された解離定数が決定的であるためには、目的タンパク質に対するF-アクチン上の結合部位の濃度が親和性よりもはるかに低くなるようにするF-アクチン濃度を用いてアッセイを実施すべきである。この基準が満たされたかどうかを確認するために、B maxから結合部位の濃度を推定する。例えば、[F-アクチン]が2μMでBmax = 0.5である場合、[結合部位]は約1μMである。 K dは[結合部位]よりも少なくとも5〜10倍大きくなければならない。測定されたK dが[結合部位]と同じオーダーの大きさである場合、観察された結合曲線は高親和性結合siの滴定を表す可能性がある真の結合等温線ではなく、これが観察される場合は、正確な親和性を測定するために、10倍低いF-アクチン濃度を用いてアッセイを繰り返す。高親和性相互作用のために、親和性を正確に測定するのに十分低いF-アクチン濃度を達成するために、ファロイジン安定化（ステップ3.3）が必要であるかもしれない。 最後に、アッセイを実施し、評価する際に研究者が認識すべき共沈降アッセイに関する根本的な制限がある。最も重要なことに、共沈降アッセイは真の平衡定数を生成しない。結合生成物（ すなわち、タンパク質+ F-アクチン）は、遠心分離の間に反応物から分離され、その後、生成物は解離して新たな平衡を作り出すことができる。その結果、共沈降アッセイは、誤った親和性の相互作用を誤って計算したり、検出しなかったりする可能性があります。多くのアクチン結合タンパク質は、Fアクチンに対して低い（ すなわち、マイクロモル）親和性を有するので、陰性の結果（ <eすなわち検出不可能な結合）は、タンパク質がF-アクチンに結合しないことを必ずしも意味しない。代替として、TIRF顕微鏡に基づく単一フィラメント結合アッセイは、解離定数を決定するために、より高感度で正確である（この技術の総説については、参考文献15,16を参照）。これらの制限にもかかわらず、ペレット化アッセイは、ほとんどの研究者の手段の範囲内であり、タンパク質がF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性を測定するための有効なツールである。

アクチンは、運動性、収縮、接着、および形態学を含む、複数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす必須の細胞骨格タンパク質である1 。アクチンは、単球球状アクチン（G-アクチン）および重合した糸状アクチン（F-アクチン）の2つの形態で存在する。細胞内では、Fアクチンの組織化はアクチンフィラメント2,3,4の核形成、成長、架橋、分解を制御する大量のタンパク質によって制御されています。しかしながら、複数のアクチン結合タンパク質がアクチンネットワークの組織化を調節するためにどのように機能するかは依然としてほとんど不明である。 タンパク質 - タンパク質相互作用の測定は、タンパク質が生化学レベルでどのように細胞行動に影響を及ぼすかを理解するための重要なアプローチである。多くの異なるアッセイを使用して、精製タンパク質間の相互作用を検出することができる。可溶性タンパク質の一般的なアプローチには、プルダウン、蛍光偏光、等温滴定熱量測定、および表面プラズモン共鳴が含まれる。重要なことに、これらのアッセイの全ては、タンパク質が可溶性であることを必要とし、したがって、Fアクチンのような高分子の糸状タンパク質での使用に適応するのが困難である。ここでは、タンパク質またはタンパク質ドメインがF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性を測定するためのテクニック、すなわちアクチン共沈降、またはペレット化アッセイを説明します。 アクチンペレット化アッセイは、超遠心分離機以外の特別な装置を必要としない比較的簡単な技術である。すべての試薬は、基本的な生化学の知識を前提に作成するか、購入することができます。 F-アクチンへの結合が確立されると、このアッセイを使用して見かけの親和性（ すなわち、解離平衡定数）を測定することができる5 。また、いったん親和性が確立されると、ペレット化アッセイ目的タンパク質の変化（ すなわち 、翻訳後修飾、突然変異、またはリガンド結合）がFアクチンとの相互作用にどのように影響するかを測定するのに有用なツールです。この手法には、アッセイを試みる前に研究者が知っておくべき限界（ 議論を参照）があります。

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 マイクロ超遠心機</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 ローター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>アクチン、ウサギ骨格筋</td><td>細胞骨格</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>ポリディカノール(Thesit)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン三リン酸 (ATP)</td><td>シグマ</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>P217</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(&beta;-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 (EGTA)</td><td>シグマ</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>オデッセイ CLx イメージングシステム</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クーマシー ブリリアントブルー R-250 染料</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>コロイダルブルー染色キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

共沈降によるf-アクチンへのタンパク質結合の測定

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

細胞内の糸状アクチン（F-アクチン）の組織化は、アクチン核形成、増殖、架橋および/または分解を制御する多数のアクチン結合タンパク質によって調節される。このプロトコルは、タンパク質またはタンパク質ドメインがF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性（ すなわち、解離平衡定数）を測定する技法、すなわちアクチン共沈降、またはペレット化アッセイを記載する。この技術では、目的のタンパク質をまず溶液中のF-アクチンとともにインキュベートする。次いで、分別遠心分離を用いてアクチンフィラメントを沈降させ、ペレット化した物質をSDS-PAGEにより分析する。目的のタンパク質がF-アクチンと結合すると、アクチンフィラメントと一緒に沈降する。結合反応の生成物（ すなわち、 F-アクチンおよび目的のタンパク質）を定量化して、相互作用の親和性を決定することができる。アクチンペレット化アッセイは、目的のタンパク質がF-アクチンと結合し、リガンド結合などのそのタンパク質への変化がF-アクチンとのその相互作用にどのように影響するかを評価するために使用される。

本発明者らは、共沈降アッセイにおいてF-アクチンへのαE-カテニンホモダイマーの結合を調べた。過去の実験から、F-アクチンに対するαE-カテニンホモダイマーの親和性は約1μMであり、 Bmaxは 11に近いことが示されているので、低濃度のF-アクチン（0.2μMではなく2μM;議論）。 0.2μMが臨界濃度未満であるため、ウサギ骨格筋G-アクチンから重合したF-アクチンを安定化するためにファロイジンを添加した（ステップ3.3）。増加する濃度のαE-カテニンホモダイマー（0.125-12.0μM）を、0.2μMのF-アクチンの存在下または非存在下でインキュベートした。試料を遠心分離し、得られたペレットを分析した（ 図1A ）。予想通り、バックグラウンドより上のF-アクチンと一緒に沈降したαE-カテニンホモダイマー（ 図1A 、F-アクチンペレットサンプルを非F-acスズペレットサンプル）。 BSAを陰性対照として用いた（ 図1B ）。結合したタンパク質を定量し、遊離タンパク質上にプロットして、相互作用の親和性を計算した（ 図1C ）。プロットされたデータはヒルの方程式に最もよく合います。計算されたK dは2.9μMであり、B maxは0.2であり、ヒル係数（h）は4.8であった。したがって、αE-カテニンホモダイマーは、以前の研究（〜1.0μMに対して2.9μMのK d）と一致して、低いマイクロモル親和性でF-アクチンに協同して結合する11 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> 図1： 高速F-アクチン同時沈降アッセイ。 （ A ）増加する濃度（0.125-12.0μM）のαE-カテニンホモダイマーを、ファロイドで安定化した0.2μMのF-アクチン（左パネル）または非存在下（右パネル）でインキュベートしたn。それらをRTで30分間インキュベートし、遠心分離した。全部（出発材料の7.5％）およびペレット化した材料（ペレット化した材料の50％）をSDS-PAGEによって分離し、クマシー色素で染色した。 （ B ）陰性対照として4μMBSAを流した。 F-アクチンを含む（+）または含まない（ - ）アクチビンを含む全サンプルおよびペレットサンプルをSDS-PAGEによって分離し、クマシー色素で染色した。 （ C ）遊離αE-カテニン（μM）に対して、Aから結合したαE-カテニン（μM/μMアクチン）をプロットし、ヒル式（赤線）に適合した。 K d 、B max 、及びヒル係数（h）が列挙される。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> 図2： アクチンペレット化定量 </strong&gt; - フローチャート。この概略図は、定量化に使用されたTotalおよびPelletサンプル（ A 、 CE ）および標準曲線（ B ）の例を含む第5章の重要なステップを概説しています。 5.13ステップ： 1 ）総サンプル（A）中の目的のタンパク質の量を測定する。 2 ）バンド強度対タンパク質質量（B）をプロットして標準曲線を作成する。 3 ）F-アクチン（ C ）と一緒に沈降する目的のタンパク質の量を測定する。 4 ）F-アクチン（ D ）の非存在下でペレット化した目的タンパク質の量を測定する。 5 ）Fをアクチンに結合したタンパク質の量を決定するためにCからDを引く。 6 ）各ペレット中のF-アクチンの量（E）を測定し、1サンプル当たりのF-アクチンの平均量を計算し、各サンプルを平均で割り出す（以下の数字はその比を示す）。 7 ）各サンプルについて、結合タンパク質の量（ステップ5で計算）をF-アクチンペレット比（ステップ6で計算）で割り、ペレットの違いを調整する。 8 ）標準曲線（ B ）を用いて、各試料中の正規化された結合タンパク質の量（質量）を計算する（工程7）。 9 ）遊離タンパク質および結合タンパク質の濃度を決定して結合曲線を作成する。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコールは、糸状アクチン（F-アクチン）と同時沈降するタンパク質の能力を試験し、結合が観察された場合に相互作用の親和性を測定する方法を記載する。

共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

本手法の全体的な目的は、タンパク質がフィラメント状アクチン（F-actin）と共に共沈降する能力を検証し、結合が観察された場合にはその相互作用の親和性を測定することです。この方法は、タンパク質がF-actinに結合するかどうかを判定するための簡便な手法です。本手法の利点は、超遠心分離機以外の特殊な装置を必要とせず、すべての試薬を自作または購入できる点にあります。まず、テキストプロトコルに従って高純度タンパク質を調製します。280ナノメートルの吸光度を測定し、タンパク質濃度を決定してください。使用直前に、タンパク質をハードスピンして不溶性タンパク質の凝集体を除去します。溶解度が懸念される場合は、遠心分離後にタンパク質濃度を再測定してください。次に、-80 °Cのフリーザーから球状アクチン（G-actin）を分注量分取り出し、急速に解凍します。G-actinに10X重合バッファーを加え、水で最終濃度1Xまで希釈します。アクチンを重合させるため、混合物を室温で1時間インキュベートします。重合後、重合した繊維状アクチン（F-actin）を4 °Cの溶液中で保存します。これにより数週間安定した状態で保持されます。保存後のF-actinを使用する前には、チューブを数回ゆっくりと反転させるか軽く叩き、すべてのアクチンが溶解し、溶液中に均一に分散していることを確認してください。テキストプロトコルに従い、目的タンパク質のF-actinへの結合を確認します。F-actinへの結合が確認されたら、タンパク質を段階希釈し、テストする最終濃度の2倍の濃度となるサンプルを7～8点含む濃度系列を作成します。例えば、テスト範囲が0.1から8 µMである場合は、1X反応バッファーを用いて、16、8、4、2、1、0.5、および0.2 µMのタンパク質希釈液をマイクロ遠心チューブに調製します。超遠心管内で、目的タンパク質を1X反応バッファーを用いて最終濃度まで希釈します。適切なサンプルにF-actinを添加します。その後、すべてのサンプルを室温で30分間インキュベートします。30分後、各サンプルから5分の1量を分取し、サンプルバッファーと混合します。これらが全サンプルとなります。超遠心機用サンプルチューブをローターにセットし、100,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。遠心分離後、各チューブから上清の4分の3を取り除き、別のマイクロチューブ内で4Xサンプルバッファーと混合します。これらが上清サンプルとなります。残りの上清は、ペレットを乱さないように注意しながら、ゲルロードチップを用いて取り除きます。次に、すべてのチューブに1Xサンプルバッファーを加え、室温で5分以上インキュベートします。インキュベーション後、p200ピペットチップを用いて、チューブのペレット部分を絶えず洗浄しながら、サンプルを8〜10回ピぺッティングします。再懸濁を促進するため、ピぺッティングの際にチップでペレットを軽く擦ってください。再懸濁したタンパク質をマイクロ遠心チューブに移します。これらがペレットサンプルとなります。最後に、全量サンプルとペレットサンプルをSDS-PAGEで分析します。タンパク質バンドの強度を広範囲かつ線形に測定できるイメージングシステムを用いて、Coomassie染色したゲルをイメージングします。濃度の異なるalpha e cateninホモ二量体を、0.2 micromolar F-actinの存在下または不在下でインキュベートしました。これらのサンプルを遠心分離し、得られたペレットを分析しました。予想通り、alpha e cateninのホモ二量体は、バックグラウンドを上回るレベルでF-actinとともに共沈しました。負のコントロールとしてBSAを用いました。結合したタンパク質量を定量し、遊離タンパク質量に対してプロットすることで、相互作用の親和性を算出しました。F-actinが既に重合している場合、この手法は4時間以内で完了できます。この手順を行う際は、遠心分離後に速やかに上清を除去し、ペレットを完全に再懸濁させることが極めて重要です。すべての結合実験と同様に、F-actinへの結合が飽和し、純度とF-actinがプラトーに達することが不可欠です。プラトーに達していなければ、正確な結合平衡定数を算出することは不可能です。共沈殿アッセイには、研究者が認識しておくべき根本的な限界があります。最も重要な点として、本アッセイでは真の平衡定数を算出できないため、結果として低親和性の相互作用を誤算したり、検出できなかったりする可能性があります。これらの限界があるものの、共沈殿アッセイはタンパク質がF-actinに結合するかどうかを判定し、その相互作用の親和性を測定するための、簡便かつ効果的なツールです。

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

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速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

このビデオでは、蛍光異方性法を使用して、蛍光標識付きShwachman-diamond症候群(SBDS)タンパク質と伸び因子様1...

蛍光異方性に基づくタンパク質間相互作用の検出

FtsZの重合は細菌の細胞分裂に必須です。このレポートでは、FtsZ重合活性を監視するための簡単なプロトコルを詳しく説明し、バッファー組成の影響について説明します。このプロトコルは、FtsZの重合に影響を与える調節タンパク質または抗菌薬とFtsZとの相互作用を研究するために使用できます。...

FtsZは重合アッセイ：シンプルプロトコルと考慮事項

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。...

タンパク質機能に2DE  - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

このプロトコルは、Rac1を含むRhoファミリーGTPaseの結合パートナーの相対的な親和性を比較します。In...

競合アッセイを使用してGTPアーゼ結合タンパク質の親和性を比較すると、

タンパク質相互作用は、細胞の機能の中心にあります。熱量分光技術は、一般に、それらを特徴付けるために使用されます。ここでは、Shwachman-ダイヤモンド症候群（SBDS）で変異タンパク質と伸長因子様1 GTPアーゼ（EFL1）間の相互作用を研究するためのツールとして蛍光異方性を説明します。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

このプロトコルでは、蛍光顕微鏡を使用して再構成された膜テザー細胞骨格ネットワークのダイナミクスを研究するための、支持された脂質二重層の形成、および細胞骨格フィラメントとモータータンパク質の添加について説明します。...

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

このプロトコルは、市販のタンパク質成分を使用してビーズの表面にアクチン彗星を生成する方法を説明しています。このようなシステムは、細胞に見られる突起構造を模倣しており、力生成の生理学的メカニズムを簡単な方法で調べるために使用できます。...

市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

多くの天然変性タンパク質は、多くの細胞プロセスにとって重要な行動である、非常に動的な生体分子凝縮物の形成に関与することが示されています。ここでは、生細胞内の生体分子凝縮物中でタンパク質が互いに相互作用するダイナミクスを定量化するための1分子イメージングベースの方法を紹介します。...

生体分子凝縮物内のタンパク質相互作用ダイナミクスの1分子測定

学ぶF-アクチンへのタンパク質結合の測定法。共沈降アッセイを用いて結合親和性を定量化し、細胞骨格タンパク質の相互作用を解析する実験手法です。超遠心分離機を使用します。

共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定

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