Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma

İsmim Devrim Gözüacık. Sabancı Üniversitesi'nde, İstanbul, Türkiye'de memelilerde otofajinin düzenlenmesi konusunda çalışıyoruz. Otofajiyi düzenleyen farklı proteinlere, yollara, RNA'lara odaklanıyoruz.

Otofajiyi incelemek için çeşitli teknikler vardır. Keşfettiğimiz farklı yolları analiz etmek için moleküler biyoloji, biyokimya ve hücre biyolojisi tekniklerini kullanıyoruz. Otofaji yolaklarını analiz etmek için immünopresipitasyon, immünofloresan teknikleri, konfokal mikroskopi ve diğer çeşitli teknikler kullanıyoruz.

Farklı tekniklerin ve tuzakların ayrıntıları ve sorun giderme çalışmaları doktora öğrencim Seçil Erbil tarafından açıklanacaktır. İmmünofloresan ve immünopresipitasyon prosedürlerinin genel amacı, bir hücredeki endojen protein-protein etkileşimlerini izlemektir. Bu yöntem, protein-protein etkileşimleri ve bunların hücresel lokalizasyonu ile ilgili temel soruları yanıtlamanıza yardımcı olabilir.

Bu tekniklerin temel avantajı, kontrole kıyasla istenen tedaviler ve koşullar sırasında etkileşim yoğunluğunu ölçme fırsatıdır. Başlamak için, hücreleri tripsin ile ayırın. Daha sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu hesaplayın.

Paketlenmiş ve otoklavlanmış kapak slaytlarını alın ve 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Bu deneyde olduğu gibi HEK293T gibi kolayca ayrılan bir hücre hattı ile çalışıyorsanız, kapak slaytlarını steril filtreli% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi ile kaplayın. 10 dakikalık inkübasyondan sonra çözeltiyi çıkarın.

Tüm poli-L-lizin buharlaşana ve kapak slaytları tamamen kuruyana kadar bekleyin. Sonra steril PBS ile yıkayın. 12 oyuklu plakaya bir mililitre ortam koyun ve kapak slaytlarını her bir oyuğa yerleştirin.

Tohum kuyu başına 20.000 hücre. Örtü kızakları üzerindeki hücrelerin homojen bir dağılımı sağlamak için aşılama sırasında ve sonrasında plakanın sallanması önemlidir. Hücrelerinize istenen ilaç ve kontrolünü, hücrelerin toplam kuluçka süresi 48 saati geçmeyecek şekilde tedavi edin.

48 saatin sonunda, kapak slaytlarındaki ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, bir davlumbaz altında, PBS'yi çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 PFA ile inkübe ederek sabitleyin. PFA ışığa duyarlı olduğundan, inkübasyon süresi boyunca plakayı alüminyum folyo ile örtün.

Ardından PFA'yı çıkarın ve numuneleri PBS ile üç kez yıkayın. Bu adımda, numuneleri kurutmamak için tek tek yıkamak önemlidir. Daha sonra tedavi koşullarınıza göre altı oyuklu bir plakayı etiketleyin ve her bir kuyucuğu Parafilm ile kaplayın.

Bu adımda Parafilm kaplama işleminden sonra pürüzsüz bir popo olmasına dikkat edin. Daha sonra kapak slaytlarını altı oyuklu plakaya yerleştirin ve her kapak slaytına 100 mikrolitre BSA-saponin karışımı koyun ve bloke etmek için buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra bloke edici solüsyonu çıkarın ve numuneleri PBS ile bir kez yıkayın.

BSA-saponin karışımında bir ila 100 primer antikor hazırlayın ve her kapak slaytına bu solüsyondan 100 mikrolitre koyun. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Kuluçka sırasında, antikorun kapak slaytları üzerinde eşit bir şekilde dağılması için plakayı sallamak daha iyidir.

Daha sonra birincil antikoru çıkarın ve örnekleri PBS ile üç kez yıkayın. BSA-saponin karışımında bir ila 500 Alexa Fluor ikincil antikoru hazırlayın ve her kapak slaytına bu çözeltiden 100 mikrolitre koyun. Alexa Fluor ışığa duyarlı olduğundan, bu adımdan sonra numuneleri karanlıkta tutmak önemlidir.

Bu nedenle, altı oyuklu plakayı alüminyum folyo ile örtün ve çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra ikincil antikoru çıkarın ve numuneleri PBS ile üç kez yıkayın. Slaytları tedavi isimlerinizle etiketleyin ve Kimwipes kullanarak etanol ile temizleyin.

Ardından her sürgünün ortasına 10 mikrolitre montaj solüsyonu koyun. Bir iğne ile, her bir kapak sürgüsünü slaytların üzerine yerleştirin. Ardından Kimwipe kullanarak fazla miktarda montaj solüsyonunu nazikçe alın.

İlk olarak, her kapak slaytını dört damla oje ile sabitleyin. Ardından kapak sürgüsünü tamamen kapatın. Numuneyi konfokal bir mikroskop kullanarak analiz edin.

Burada, son makalemizden alınan bu protokol kullanılarak elde edilen bir kolokalizasyon sonucu örneğini görüyorsunuz. Bu videoda endojen RACK1 proteini yeşil renkle, endojen LC3 proteini ise kırmızı ile boyandı. Birleştirme resimlerinde oluşan sarı noktalar, yeşil ve kırmızı sinyallerin çakıştığı yerlerdir.

Başka bir deyişle, sarı noktalar bu iki proteinin kolokalizasyonunu temsil eder. İmmünopresipitasyon, protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılan başka bir yöntemdir. Başlamak için, her koşul için 15 santimetrelik Petri kaplarında dört milyon HEK293T hücresi tohumlayın.

Hücrelerin toplam kuluçka süresi 48 saati geçmeyecek şekilde hücrelere istenen ilaçlarla muamele edin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri buz gibi soğuk PBS ile hasat edin. HEK293T hücreleri plakadan kolayca ayrılır.

Bu nedenle, plakayı PBS ile pipetleme ile yıkamak, tüm hücreleri koparmak ve hasat etmek için yeterlidir. Hücrelerinizi Eppendorf Tüplerinde toplayın ve 15 dakika maksimum hızda dört derecede santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı atın ve hücre peletini pipetleme ile yeniden süspanse ederek bir mililitre PBS ile yıkayın.

Sonra tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra hücre peletini proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 15 saniye boyunca girdap haline getirin ve Eppendorf Tüpünü beş dakika boyunca buz üzerinde tutun.

Girdaplamayı beş dakikada bir kez beş kez tekrarlayın. Daha sonra numuneyi en yüksek hızda 15 dakika boyunca dört derecede santrifüjleyin. Sonra süpernatanı alın ve hücre kalıntılarından tamamen kurtulmak için tekrar santrifüjleyin.

Protein lizatlarını bir ila 50 oranında seyreltin ve boş, standartlar ve seyreltilmiş numunelerle 96 oyuklu bir plaka hazırlayın. Bunları Bradford çözeltisi ile bir ila 20 oranında karıştırın, karanlıkta 15 dakika bekleyin ve optik yoğunluğu 595 milimetrede ölçün ve her numune için absorbans değerlerini kullanarak protein konsantrasyonunu hesaplayın. Daha sonra boncukları antikor eşleşmesi için hazırlayın.

200 mikrolitrelik bir ucun kenarını makas kullanarak kesin ve her koşul için boncuk bulamacından 25 mikrolitre alın. Boncukları bir kez PBS ile, bir kez RIPA tamponu ile ve bir kez proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncukları proteaz inhibitörleri içeren 300 mikrolitre RIPA tamponunda tekrar süspanse edin ve aşağı çekmek istediğiniz proteine özgü 1.5 mikrogram antikor ekleyin.

Antikor ve boncuk karışımını gece boyunca döndürücü üzerinde dört derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, boncukları proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu ile yıkayın ve her koşuldan iki miligram toplam hücre lizatı yükleyin. Toplam hacmi 300 mikrolitreye kadar proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu ile doldurun ve gece boyunca dört derecede döndürücü üzerinde inkübe edin.

Daha sonra boncukları proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, daha küçük bir pipet kullanarak, boncuklara dokunmadan tüm süpernatanı almaya çalışın. Ardından 10 mikrolitre 3X yükleme boyası ekleyin.

Ko-immünopresipitasyon deneyinde kontrol edilecek proteinlerin endojen ekspresyonunu kontrol etmek için, en az 100 mikrogram protein lizatı kullanarak girdi numuneleri hazırlayın. Her numuneye uygun hacimde 3X yükleme boyası ekleyin. IP ve giriş kontrol örneklerini denatüre etmek için 95 derecede 10 dakika kaynatın.

Daha sonra, western blot yaparak proteinleri boyutlarına göre ayırmak için numuneleri döndürün ve SDS jele yükleyin. Protein örneklerini SDS jelinden geçirin ve ardından proteinleri nitroselüloz membranlara aktarın. Islak transfer yapıldıktan sonra, nitroselüloz membranı% 5 yağsız süt çözeltisi ile çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe ederken kurulayın.

Daha sonra membranı PBS-Torin solüsyonunda üç kez, oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde beş dakika yıkayın. Zarı, oda sıcaklığında bir saat boyunca tespit etmek istediğiniz proteine özgü birincil antikorda inkübe edin. Primer antikorları kalitelerini kaybetmeden tekrar kullanabilmek için kırmızı solüsyon içinde hazırlamayı tercih edebilirsiniz.

Primer antikor inkübasyonundan sonra, PBS-Torin yıkama adımlarını üç kez tekrarlayın. Daha sonra% 5 yağsız sütte HRP konjuge ikincil antikor çözeltisini hazırlayın ve çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca zarla inkübe edin. İnkübasyondan sonra, yıkama adımlarını tekrar tekrarlayın.

Daha sonra ev yapımı ECL solüsyonu hazırlayın ve membranı bir kasete yerleştirin. Ardından, metinde tam bir diyagramda açıklandığı gibi düzeltme adımlarınızı geliştirmeye devam edin. Filmi sabitledikten ve kuruttuktan sonra, belirli bandı tahmin edebilmek için zarın kenarlarına ve protein harfine göre işaretleyin.

Tüm bu antikor inkübasyon adımlarını tekrarlayın ve ardından etkileşimi kontrol etmek istediğiniz tüm proteinler için karanlık oda prosedürlerini izleyin. Ardından sonuçları analiz edin. Burada, son makalemizden alınan endojen bir immünopresipitasyon sonucunu görüyorsunuz.

Bu videoda endojen ATG5 proteini çökeltildi ve farklı koşullar altında endojen RACK1 ko-immünopresipitasyon seviyeleri kontrol edildi. Bu prosedürleri denerken, farklı tedaviler üzerine niceliksel etkileşim seviyelerini toplamak için pozitif ve negatif kontrollerle mümkün olduğunca çok biyolojik tekrara sahip olmayı hatırlamak önemlidir. Tüm biyolojik kopyaların verdiği genel resim, farklı koşullar altındaki etkileşim modeli olarak tanımlanır.

Bu videoyu izledikten sonra, protein-protein etkileşimlerinin dinamiklerini nasıl arayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.