Name: 胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージングウテロのエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: 学ぶマウス胚脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング法。ウテロ電気穿孔を用いて遺伝子発現を操作し、新皮質発達における神経細胞の極性形成と移動の分子メカニズムを動的に解析する強力なツールです。

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私たちはJacqueline Andratschke、Elena Werle、Sachi Takenaka、Matthias Tobererに優れたテクニカル・アシスタンス、そしてVictor Tarabykinに有益な議論をしてくれたことに感謝します。この作業は、Deutsche ForschungsgemeinschaftのSB（BR-2215）への助成によって支えられました。

すべての実験手順は、動物福祉委員会（RegierungspräsidiumTübingen）によって承認され、ドイツ動物福祉法およびEU指令2010/63 / EUに従って実施された。 1. Uteroエレクトロポレーション<ol><li> マイクロインジェクション針 <ol><li>ボックスフィラメント（2.5mm×2.5mm）を備えたマイクロピペットプラーおよび以下のプログラムを使用して、ホウケイ酸ガラス細管（外径：1.0mm、内径：0.58mm、長さ：100mm）をマイクロインジェクション針に引っ張る：HEAT：540、PULL ：125、VELOCITY：20、DELAY：140。RAMPテスト（HEAT値：RAMP + 25）を実行して、個々のフィラメントのHEAT値を決定します。 </li><li>胚の日（E）13.5以下で注射するための20〜30μmのチップサイズを得るために、38°の角度および高回転速度の中間の微小針で、より古い胚で注射するために30〜40μmステージ。保管のために、チップへの損傷を防ぐために粘土を模造したボックスまたはペトリ皿に針を固定する。 </li></ol></li><li> プラスミドDNA溶液 <ol><li>エンドトキシンを含まないマキシ調製キットを使用して、製造者の指示に従って、蛍光レポータータンパク質（ 例えば、 GFP）を含むプラスミドDNA構築物を調製する。 </li><li>終濃度0.01％のFast Greenを含むエンドトキシンフリーのTris-EDTAバッファーでプラスミドDNA溶液を1〜2μg/μLの最終濃度に希釈する。 -20℃でアリコート溶液と保存します。 </li></ol></li><li> 静菌性塩化ナトリウム溶液 <ol><li>等張性の0.9％塩化ナトリウム溶液に0.9％の最終濃度でベンジルアルコールを加えることによって静菌性塩化ナトリウム溶液を調製する。使用直前に滅菌フィルター溶液。 </li></ol></li><li> カルプロフェン注射液 <ol><li>カルプロフェン注入液を調製する0.5mg / mLの最終濃度の滅菌等張性0.9％塩化ナトリウム溶液にカルプロフェンを添加する。 4℃で最大28日間保存する。 </li></ol></li><li> 麻酔、DNA注射、エレクトロポレーション <ol><li> E14.5妊娠マウスの体重を測定し、気化器に接続した透明な麻酔室に入れ、5％イソフルランで飽和させる。動物が意識不明のときは、37℃の加温プレートに添付されている麻酔マスクに移し、1.8〜2.2％のイソフルランで麻酔をかけたままにしておきます。 注：尾のピンチと脚の痛み（つまみ）の喪失による外科的麻酔の発達を評価する。 </li><li>鎮痛のために、10mgのマウス体重（5mg / kg体重）あたり100μlのカルプロフェン注射液を皮下注射する。後ろにマウスを置いて、石油ゼリーで目を慎重に覆い、乾燥を防ぎます。 </li><li>穏やかに手足を広げて固定する外科用テープで暖かいプレートに貼り付けます。腹部を70％エタノールで滅菌し、次にセルローススワブを用いてヨウ素溶液（7.5mg / mL）を滅菌する。適切な消毒を確実にするために、この手順を3回繰り返します。 </li><li>腹部を滅菌ガーゼで覆い、切開部を切開して腹部切開用の欄（直径2〜2.5cm）を用意します。静菌性塩化ナトリウム溶液でガーゼを湿らせます。 注意：ペダル・リフレックスの喪失による手術麻酔の発生を再評価する。 </li><li>マイクロアドソンを使用して鉗子（鋸歯状、長さ：12cm）および細いはさみ（横に角度を付け、長さ：9cm）は、腹部の中心線に沿って約1.5cmの皮膚を切断する。ラインナ・アルバに沿って下の筋肉を切る。 </li><li>リング鉗子（長さ：9 cm、外径：3 mm、内径：2.2 mm）で子宮角を1つ取り外し、湿らせたガーゼの上に静かに置きます。 注意：子宮角をリング鉗子で胚と胚の間にのみ保持する胎盤や任意の供給容器を摂動させないでください。静菌性塩化ナトリウム溶液で常に子宮を湿らせてください。 </li><li>慎重にリング鉗子で胚を配置し、矢状洞に平行な三日月形の影として提示側脳室を見つける。注射部位は、色素性眼と副鼻腔の合流部との間の線のほぼ中央に位置し、矢状洞が2つの横鼻に分岐する。マイクロ注射針を子宮壁を通して側脳室に押し込む。 注：必要に応じて、針の引き込みによって注射の深さを補正することができます。 </li><li> 25psi、1パルスあたり10〜20ms、および5〜10パルスを使用して、フットペダルで操作されるマイクロインジェクタを用いて、1〜2μLのDNA溶液を側脳室に注入する。成功した注射は、心室系を満たすべき有色DNA溶液によってモニターすることができる。 </li><li> 「陽性」末端が注入された心室と同じ側にあり、「陰性」末端が陰性であるようにピンセット型電極（E13.5またはそれ以下の場合は直径3mm、E14.5またはそれ以上の場合は直径5mm）胚の頭の耳の下の注入された心室の反対側にある。 </li><li>電気穿孔部位を数滴の静菌性塩化ナトリウム溶液で湿らせ、950msの間隔で50msの持続時間の5つの電流パルス（E13.5以下では35V、E14.5以上では40V）を印加する。 注：正常なエレクトロポレーションのためには、通常60〜90 mAの電流で十分です。より低い電流はニューロンを効率的にトランスフェクトしないが、より高い電流は胚死につながる可能性がある。 </li><li>子宮角のすべての胚について、手順（手順1.5.7〜1.5.10。）を繰り返し、腹腔内に静かに戻します。 </li><li>子宮角を反対側から取り出して、procを繰り返しますステップ1.5.7で説明したedure。 1.5.11。 </li><li>マイクロアドソン鉗子、Mathieu針ホルダー（炭化タングステン、長さ：14cm）、および非吸収性外科縫合糸（3/8円、13mm、テーパー点）を使用して皮膚を縫合する前に、筋層を縫合して腹腔を閉じる。 注意：縫合中に子宮やその他の臓器を摘出しないように注意してください。 </li><li>皮膚縫合糸をヨウ素溶液（7.5 mg / mL）で慎重に消毒し、セルローススワブを使用して眼周囲過剰の石油ゼリーを静かに除去する。マウスが目を覚ますまで赤外線ランプの下に置きます。次の2日間、マウスを密接に監視する。 12〜24時間後に、ステップ1.5.2に記載されているように鎮痛処置を繰り返す。 </li></ol></li></ol> 2.有機型スライスの文化<ol><li> ラミニンストック溶液 <ol><li> 1mgの凍結乾燥ラミニンを滅菌水に溶解して、1mg / mLラミニンストック溶液を得る。 50μLのアリコートを調製する-80℃で保管してください。 </li></ol></li><li> ポリ-L-リジンストック溶液 <ol><li>滅菌水に50mgのポリ-L-リシンを溶解して、1mg / mLのポリ-L-リジン保存溶液を得る。 0.5 mLのアリコートを調製し、-20°Cで保存する。 </li></ol></li><li> 完全なハンクの平衡塩類溶液（完全なHBSS） <ol><li> 50mLの10×HBSS溶液、1.25mLの1M HEPES緩衝液（pH7.4）、15mLの1M D-グルコース溶液、5mLの100mM塩化カルシウム溶液、5mLの100mM硫酸マグネシウム溶液、および1M炭酸水素ナトリウム溶液2mLを加えた。 0.5Lまでの滅菌水、滅菌フィルターを加え、4℃で保存する。 </li></ol></li><li> スライス培養培地 <ol><li>基本培地Eagle（BME）35mL、完全HBSS（セクション2.3.1参照）、1M D-グルコース1.35mL、200mM L-グルタミン0.25mLおよびペニシリン - ストレプトマイシン0.5mLを、スライスカルチャー50 mLを得る中。滅菌濾過し、ウマ血清を最終濃度5％になるまで添加する。 4℃で4週間保存してください。 </li></ol></li><li> 低融点（LMP）アガロース溶液 <ol><li> LMPアガロース1.5gを50mLの完全HBSSに溶解して3％LMPアガロース溶液を調製し、電子レンジで1〜2分間中間出力で加熱する。 注：沸騰中のオーバーフローを防ぐため、熱を注意深く監視してください 。 </li><li>使用準備が整うまで38℃の水浴に入れてください。 4℃で保存し、一度再使用してください。 </li></ol></li><li> メンブレンインサートのコーティング <ol><li>ラミニン原液（ステップ2.1.1参照）とポリ-L-リシン原液（ステップ2.2.1参照）のアリコートを6 mLの滅菌水に加えてコーティング溶液を得ます（6インサートに十分です） 。 </li><li>各ウェルの底に2mLの滅菌水が入った6穴プレートに膜インサートを入れます。 1mLのコーティング溶液（ステップ2.6.1参照）を各膜の上に置き、37℃および5％二酸化炭素雰囲気下で一晩インキュベートする。 注：ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）膜などの光学的に透明なメンブレンを使用したインサートのみを使用してください。 </li><li>膜を1mLの滅菌水で3回洗浄し、乾燥させる。同じ日にコーティングされた膜を使用するか、4℃で4週間、清潔な6ウェルプレートに保存してください。 </li></ol></li><li> 脳の解剖と埋め込み <ol><li>エレクトロポレーションの2日後、気化器に接続した透明チャンバーにマウスを置き、5％イソフルランで飽和させる。動物が意識がなくなったら、それをチャンバーから取り出し、子宮頸管脱臼によって犠牲にする。 </li><li>胚を含む子宮を取り出し、氷冷した完全なHBSSを含む10cmのペトリ皿に入れる。 注：この時点以降、すべての溶液、胚、および脳を氷上に保ちます。 </li><li>実体顕微鏡を使用して、細かい先端の鉗子（ストレート、11 cm）とVannasTübingenSpring Scissors（角度をつけて、長さ：9.5 cm）を用いて各胚を子宮から分離し、それを氷冷完全HBSSを含む別のペトリ皿に移す。 </li><li>脳幹のレベルで切開を行い、矢状の中線に沿って切る。脳を覆う皮膚と軟骨を剥がす。脳幹を脳半球のすぐ後ろで切断し、頭蓋骨から脳を取り除く。マイクロスプーンスパチュラ（185mm×5mm）で脳を氷冷完全HBSSを含む12ウェルプレートに移す。 12穴プレートのリターからすべての脳を採取する。 </li><li>蛍光の実体顕微鏡を使用して、エレクトロポレーションされた領域の大きさだけでなく、蛍光の明るさについて12ウェルプレートの脳をスクリーニングする。さらなる処理のために、推定体性感覚皮質の明るい蛍光シグナルを有する2〜4頭の脳を選択する。 </li><li> 38℃に保った3％LMPアガロース溶液を剥がして使い捨て可能な埋込み型に注ぎます。リムーバブル脳をマイクロスプーンスパチュラで12ウェルプレートから取り出し、精密ティッシュペーパーを用いて脳周囲の過剰な完全HBSSを注意深く排出する。 </li><li>脳をアガロース溶液に静かに置き、金型の底に押し込み、20ゲージの針を用いてその位置を注意深く調節する。冠状切片の場合、嗅球が上を向くように脳を向ける。金型を氷上に置き、アガロース溶液が凝固し、脳切片化を続け​​る。 </li></ol></li><li> ビブラトームセクショニングとスライス培養 <ol><li>金型からアガロースブロックを取り出し、滅菌ペトリ皿の蓋の上に置きます。余分なアガロースを、嗅球より約2〜3mm、反対側に1mmのアガロースを残す清潔なかみそりの刃で取り除く。シアノアクリレート接着剤を使用して、嗅球を下向きにしてトリムしたアガロースブロックを検体ステージに固定します。 注：70％エタノールで滅菌する機器および機器lである。 </li><li>氷冷した完全なHBSSを含む振動ブレードミクロトームのスライシングチャンバーに試料ステージを移し、背側をブレードに向かって配置する。 0.9mmの低〜中程度の振幅および0.09〜0.12mm /秒の非常に遅い切片化速度を有するエレクトロポレーションされた領域を含む250μm厚の脳スライスを切る。通常、明るい蛍光シグナルを有する4〜6スライスは、うまくエレクトロポレーションされた各脳から得られる。 </li><li>曲がったマイクロスプーンのスパチュラと細かい先端の鉗子で、周囲のアガロースを含む脳スライスを、氷冷した完全なHBSSを含む6ウェルプレートに注意深く移す。 注意：移送中に鉗子で切片周辺のアガロースリムに触れるだけで脳組織を傷つけないように注意してください。 </li><li>手順2.8.1で説明したように、選択したすべての脳を処理します。 2.8.3に。 </li><li> 100μLの完全なHBSSでメンブレンインサートを湿らせてから、脳slスライスの位置決めを容易にするために膜上に固定される。 1つのメンブレンインサートに最大5枚のスライスを配置できます。 </li><li>慎重に、曲がったマイクロスプーンのスパチュラと細かい先端のついた鉗子を使用して、スライスをメンブレンに移します。鉗子でアガロースリムに触れるだけで、スパチュラ上のスライスを静かに引っ張り、スパーテルからスライスをメンブレン上に静かに押します。鉗子を使用してスライスを配置し、残りのスライスを引き続き転送します。余分な完全HBSSをピペットで取り除く。 注：スライスを互いに重ならないでください。 </li><li>鉗子の助けを借りて、1.8mLのスライス培地（ステップ2.4.1参照）を含む6ウェルプレートに、スライスを入れた膜インサートを注意深く入れ、37℃および5％二酸化炭素雰囲気下で、時間経過までインキュベートするイメージング。 </li></ol></li></ol> 3.タイムラプスイメージング<ol><li> 顕微鏡設定 <ol><li>気候チャンバーをステージの上に置く倒立共焦点顕微鏡を用いて37℃、5％二酸化炭素雰囲気下で培養した。ハイブリッド検出器を使用してレーザー強度を低減し、細胞生存率を向上させます。詳細な解析を行うには、開口数0.6以上の超長作動距離40X乾式対物レンズを使用してください。 注：顕微鏡のすべてのコンポーネントは、イメージングプロセスの間に安定した焦点を提供するために、イメージング前に2〜3時間37℃に予熱する必要があります。 </li></ol></li><li> スライスイメージング <ol><li>倒立蛍光顕微鏡を使用して膜インサートを含む6ウェルプレートからイメージング用の脳スライスを選択する。 注意：紫外線による長時間の曝露は避けてください。細胞の光損傷を引き起こす可能性があります。 注意：上部SVZの明るい単一ニューロンをスライスのスライス面に向かって放射状に移動させてスライスを選択します。 CP全体にわたる放射状グリア細胞の微細な蛍光プロセスは、無傷の放射状グリア骨格を示し、これは、半径方向に移動する皮質ニューロンによって達成される。 </li><li>鉗子の助けを借りてスライス培地2mlを含む直径50mmのガラス底のディッシュに、タイムラプスイメージングのために選択されたスライスで膜インサートを移す。皿を共焦点顕微鏡の気候室に置く。 </li><li>解像度を512×512ピクセルに設定し、スキャン速度を400 Hzから700 Hzに上げ、フレームレートを毎秒約1.4から約2.5フレームに上げます。平均を2回以上使用しないでください。電気穿孔された領域（通常400〜100μm）に1.5μmのステップサイズでzスタックを定義します。集合的に、これらの設定は、取得中に光損傷を低く保ちながら、画像の十分な解像度および明るさを可能にする。 30分ごとにzスタックを取って、時間経過シリーズを開始します。 注：レーザー光へのスライスの長時間の曝露は、光損傷を誘発し、細胞の生存率を低下させる。 expを調整するそれに応じてレーザ光を照射する。 </li><li> ImageJソフトウェア（https://imagej.nih.gov/iij/）または同等のものを使用して、時間経過シリーズを分析する。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

放射状移動は、新皮質発達における重要なプロセスである。このプロセスの異なる工程に影響を与える遺伝子の変異は、滑脳症と白質heterotopia 1、2を含む重篤な皮質奇形を引き起こす可能性があります。我々は最近、若い移動する皮質突起ニューロンにおいて発現されるBcl11aが、放射状移動において役割を果たすことを示した。我々は、エレクトロポレーションされた脳の急性皮質切片における移動ニューロンの経時的共焦点イメージングを使用して、移動するニューロンにおけるBcl11aの遺伝子欠失が分極および移動の欠陥を引き起こすことを直接実証した。経時変化シリーズを使用して、個々のニューロンの移動経路を追跡し、速度プロファイル、平均移動速度、および移動方向を含む、移動するニューロンの特定のパラメータを計算した10 。 このプロトコルは、分子を研究する際の重要なアプローチを記述する半径方向の移動における機構。短いヘアピン...

新皮質は、認知機能、感情機能、および感覚運動機能の主要な部位である。それは、脳の表面に平行に向けられた6つの水平な層で構成されています。発達中、背側終脳の外側壁の前駆細胞は、突起表面に放射状に移動し、層タイプ特異的なニューロンの同一性を獲得する突起ニューロンを生じる。心室/脳室区域（VZ / SVZ）で生成された後、これらのニューロンは過渡的に多極となり、移動を遅らせる。中間ゾーン（IZ）に短時間滞在した後、両極性モルフォロジーに切り替え、放射状グリア骨格に付着させ、皮質プレート（CP）への放射状配向移行を続ける。最終的な標的投影に到達すると、ニューロンは、放射状グリアプロセスから分離し、層特有の同一性を獲得する。ニューロン移動の異なる段階に影響を与える遺伝子の突然変異は、リッスンなどの重度の皮質奇形を引き起こし得るephalyまたは白質heterotopia 1、2。 子宮内エレクトロポレーションではげっ歯類の胚3、4の脳の発達に神経前駆細胞をトランスフェクトするために迅速かつ強力な手法です。この技術により、発達中のニューロンにおけるそれらの機能を研究するために、目的の遺伝子をノックダウンおよび/または過剰発現させることが可能である。この方法は、具体的には、形態学的な詳細を説明し、半径方向の移動5、6、7、8、9のプロセスの分子機構を特徴づけるために役立っています。放射状に移動するニューロンは、細胞の形状、移動速度、および移動方向の動的変化を経るが、時間の経過とともに直接的かつ連続的な観察が必要である。オルガノタイプのスライスカルチャーエレクトロポレーションされた脳の再構成および経時的共焦点画像化は、経時的に移動するニューロンを直接観察することを可能にする。この組み合わされたアプローチを使用して、エレクトロポレーションされた脳の固定された組織切片において調査することができない、移動するニューロンの明確な特徴を分析することが可能である。 私たちは最近、皮質発達中の転写因子B細胞CLL /リンパ腫11a（Bcl11a）の役割を研究するために、エレクトロポレーションされた脳のスライス培養における移動ニューロンの時間経過共焦点画像化を適用した10 。 Bcl11aは、若い移動する皮質ニューロンにおいて発現され、その機能を研究するために条件付き突然変異Bcl11a対立遺伝子（ Bcl11a flox ） 11を使用した。緑色蛍光タンパク質（GFP）とともにCreリコンビナーゼをBcl11a flox / flox脳の皮質前駆細胞に電気穿孔することにより、モザイク変異体の状況を作り出した。そうでなければ野生型の背景。このようにして、単一細胞レベルでBcl11aの細胞自律機能を研究することが可能であった。我々は、 Bcl11a突然変異体ニューロンが、移動中の速度の低下、速度プロファイルの変化、およびランダムな向きの変化を示すことを見出した10 。概説されたプロトコールでは、マウス脳のエレクトロポレーションおよびスライス培養調製12の成功のワークフローならびに皮質切片培養の経時的共焦点画像化を記載する。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット研究所&nbsp;</td><td>506949</td><td>Forene</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>非吸収性外科用縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>K890H</td><td>3/8 円、13 mm、テーパーポイント</td></tr><tr><td>マイクロ アドソン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11018-12</td><td>鋸歯状、長さ:12 cm</td></tr><tr><td>細かいハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14063-09</td><td>側面に角度をつけて、長さ:9 cm</td></tr><tr><td>Mathieu ニードルホルダー</td><td>Fine Science Tools</td><td>12510-14</td><td>炭化タングステン、長さ:14 cm</td></tr><tr><td>先端の細かい鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>ストレート、11 cm</td></tr><tr><td>Vannas T&uuml;bingen 春はさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15005-08</td><td>角度付き、9.5 cm</td></tr><tr><td>リング鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11103-09</td><td>OD: 3mm、内径、2.2 mm、長さ: 9 cm</td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Gibco</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>馬用血清</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>26050088</tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス 毛細血管</td><td>ハーバード装置</td><td>30-0016</td><td>1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>麻酔システム</td><td>ハーバード Apparaus</td><td>72-6471</td><td></td></tr><tr><td>麻酔室</td><td>ハーバード Apparaus</td><td>34-0460</td><td></td></tr><tr><td>フルオサーバー フィルター キャニスター</td><td>ハーバード Apparaus</td><td>34-0415</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロー</td><td>ス Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>振動ブレードミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光組織培養顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SP5II</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリッド検出器</td><td>ライカ</td><td>HyD</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ、40倍/0.60NA</td><td>ライカ</td><td>11506201</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡温度制御システム</td><td>ライフイメージングサービス</td><td>キューブ、レンガ&ボックス</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インサート</td><td>ミリポア</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>マイクログラインダー</td><td>ナリシゲ</td><td>EG-45</td>は、マイクロインジェクターパーカーハニフィン&nbsp<td>を面取りするための38°deg;角度を使用します</td></tr><tr><td></td><td>。</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III</td></tr><tr><td>carprofen</td><td>ファイザー アニマルヘルス</td><td>NDC 61106-8507</td><td>リマジル</td></tr><tr><td>emdedding mold</td><td>Polysciences</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>エンドトキシンフリープラスミド マキシキット</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーン</td><td></td><td>Sigma F7252</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-リジン</td><td>シグマ</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マゲンシウム</td><td>シグマ</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>方形波エレクトロポレーター</td><td>ソニデル</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>5 mmプラチナディスク電極付きピンセット</td><td>Sonidel</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ボックスフィラメント</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB255B</td><td>2.5 mm x 2.5 mm</td></tr><tr><td>マイクロスプーンスパチュラ</td><td>VWR</td><td>231-0191</td><td>185 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>ガラス底皿、50 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr></tbody></table>

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

子宮内でエレクトロポレーションは、発生中のマウス胚の大脳皮質における放射状移動のプロセスを研究するための迅速かつ強力なアプローチである。これは、半径方向移動の異なるステップを記述し、このプロセスを制御する分子メカニズムを特徴付けるのに役立っている。マイニングするニューロンを直接的かつ動的に分析するためには、時間の経過とともに追跡されなければならない。このプロトコールは、 子宮内のエレクトロポレーションと器官型のスライス培養および経時的な共焦点画像化を組み合わせたワークフローを記述しており、放射状に移動する皮質ニューロンの直接的検査および動的分析が可能である。さらに、移動速度、速度プロファイル、および半径方向の変化など、移動するニューロンの詳細な特徴付けが可能である。本方法は、救助実験と同様に、喪失および機能獲得によって、放射状に移動する皮質ニューロンにおける目的の遺伝子の機能的分析を行うために容易に適合させることができる。時間経過移動ニューロンの画像化は、かつて確立された最先端技術であり、ニューロン移動障害のマウスモデルにおける大脳皮質の発達を研究するための有力なツールである。

以前は、 子宮の電気穿孔によるBcl11aの遺伝子欠損は、晩年生まれの上層投射ニューロンの放射状移動を損なうことを示しています10 。 Cre-IRES-GFPを含むDNAプラスミドベクターのエレクトロポレーションは、条件付きBcl11a flox / flox脳11においてBcl11aを効率的に欠失させた。電気穿孔の3日後にE14.5電気穿孔脳を分析したところ、ほとんどのコントロールニューロンはCPに移行したが、多くのBcl11a変異ニューロンはIZおよびVZ / SVZの移動経路に沿って失速した。さらに、 Bcl11a欠損時にIZに特異的なバイポーラ細胞を犠牲にして多極細胞の数が増加することを見出し、分極の欠陥を示唆した10 。 <p class="jov...

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

本手順の全体的な目的は、エレクトロポレーションを施した胚脳から調製した臓器型スライス培養において、放射状に移動するニューロンをタイムラプス共焦点顕微鏡で直接観察することです。この手法は、新皮質発達の重要な側面の研究に役立ちます。これにより、ニューロンの極性形成に関与する分子メカニズムや、脳内の最終目的地へのニューロンの放射状移動についての調査が可能になります。この手法の主な利点は、移動速度プロファイル、平均移動速度、および移動方向の変化を含む、移動ニューロンの動的な特性を分析できることです。まず、適切に麻酔をかけた妊娠マウスを、ウォーミングプレート上の仰臥位に配置します。足底反射がないことを確認してください。その後、乾燥を防ぐため、眼をワセリンで丁寧に覆います。次に、四肢をゆっくりと広げ、外科用テープで加温プレートに固定します。腹部を70% ethanolで拭き、続いてヨウ素液で消毒した後、腹部切開用に切り込みを入れた滅菌ガーゼを腹部に当てます。細菌静止剤含有塩化ナトリウム溶液でガーゼを湿らせます。足底反射の消失により外科的麻酔の状態を再確認した後、ギザ付きマイクロアドソン鉗子と角度付き微細剪刀を用いて、腹部正中線に沿って皮膚を約1.5センチメートル切開します。次に、白線に沿って下層の筋肉を切開します。リング鉗子で胚の間の子宮角を把持し、胎盤や供給血管を乱さないように、湿らせたガーゼの上に静かに置きます。次に、矢状静脈洞に平行な三日月形の影として現れる側脳室が明確に見えるように、胚を慎重に配置します。注入部位は、色素沈着した眼と、矢状静脈洞が2つの転移静脈に分かれる静脈洞合流点を結ぶ線の中間にあります。標的を特定した後、マイクロインジェクション針を子宮壁から側脳室へと刺入します。次に、フットペダルで操作するマイクロインジェクターを用い、5～10回のパルスで1～2 µLのDNA溶液を注入します。注入の成否は、脳室系を満たす着色されたDNA溶液によって確認できます。次に、陽極が注入した心室側に、陰極が注入した心室の反対側で胚の頭部の耳の下にくるように、ピンセット型電極を配置します。エレクトロポレーション部位に静菌性塩化ナトリウム溶液を数滴滴下して湿らせ、50ミリ秒のパルス幅、950ミリ秒の間隔で、電気パルスを5回印加します。陰極に気泡が発生していれば、電流が流れていることを示します。通常、エレクトロポレーションを成功させるには60から90ミリアンペアで十分です。電流が低すぎるとニューロンへの導入効率が低下し、高すぎると胚死亡につながる可能性があります。第一子宮角のすべての胚に対してこの手順を繰り返した後、慎重に腹腔内に戻します。筋層と皮膚を縫合した後、ヨウ素溶液で慎重に消毒し、セルロース綿棒を用いて眼から पेट्रोलियम jellyを優しく取り除きます。マウスを赤外線ランプの下に置き、覚醒するまで待ちます。承認された方法で妊娠した雌を安楽死させた後、胚を含む子宮を摘出し、氷冷した complete HBSSを入れた10 cmのペトリ皿に移します。ここからは、すべての溶液、胚、および脳を氷上に保持してください。実体顕微鏡下で、極細ピンセットとVannas Tubingenばね式剪刀を使用し、各胚を子宮から分離します。分離した胚を、氷冷した完全HBSSを含む別のペトリ皿に移します。脳幹の高さで切開し、正中矢状面に沿って切断します。脳を覆っている皮膚と軟骨を剥がします。次に、大脳半球の直後で脳幹を切断し、頭蓋骨から脳を取り出します。マイクロ spoons スパチュラを用いて、脳を氷冷した完全 HBSS を含む 12ウェルプレートに転移させます。1つのリターから得られたすべての脳を 12ウェルプレートに回収します。次に、蛍光実体顕微鏡を使用して、12ウェルプレート内の脳の蛍光強度および電気穿孔領域の大きさをスクリーニングします。鮮明な蛍光シグナルが認められ、体性感覚皮質と思われる部位がある脳を2～4個選び、以降の処理に用います。次に、溶融した3%低融点アガロース溶液を、剥離可能な使い捨て埋め込み型モールドに注ぎます。マイクロスプーンスパチュラを使用して12ウェルプレートから脳を取り出し、微細組織紙を用いて脳周囲の余分な完全HBSSを慎重に拭き取ります。脳をアガロース溶液の中に静かに置きます。次に、20ゲージの針を使用して、脳をモールドの底まで押し込み、慎重に位置を調整します。冠状断を作成する場合は、嗅球が上を向くように脳の向きを調整してください。アガロース溶液が凝固するまで、モールドを氷上に保持し、その後、脳の切断に進みます。清潔なカミソリを用いて、脳周囲の余分なアガロースを切り取り、嗅球を除いて、全周囲に約1 mmのアガロースが残るようにします。嗅球の周囲には2〜3 mmのアガロースを残してください。標本に少量のシアノアクリレート系接着剤を塗布した後、嗅球を下向きにして、切り出したアガロースブロックを固定します。検体を氷冷した完全HBSSを含む振動刃マイクロトームのスライスチャンバーに移し、脳の背面を刃に向けて配置します。低から中程度の振幅、および極めて低速の切断速度で、電気穿孔領域を含む250 micron厚の脳切片を作成します。通常、電気穿孔に成功した各脳から、強い蛍光信号を持つ切片が4枚から6枚得られます。細先のピンセットで1つの切片のアガロース縁を掴み、曲がったマイクロスプーンスパチュラの上に切片を引き出します。この方法で、脳切片を氷冷した完全HBSSを含む6ウェルプレートに慎重に移します。ラミニンコーティングされたメンブレンインサートを100 µLの完全HBSSで湿らせます。次に、曲げられたマイクロスプーンスパチュラとピンセットを使用して、スライスを慎重にメンブレン上に転写します。スパチュラからメンブレンに向けてスライスをそっと押し出し、その後ピンセットで位置を調整します。残りのスライスについても同様に転写を続けてください。1枚のメンブレンインサートに最大5枚のスライスを配置できます。ピペットで過剰な完全HBSSを除去します。次に、ピンセットを用いて、スライスが入ったメンブレンインサートを、1.8 millilitersのスライス培養液が入った6ウェルプレートに注意深く配置します。倒立顕微鏡でスライスを観察し、イメージングに適した脳スライスを選択します。スライス表面に向かって放射状に移動している、上部SVZの輝度の高い単一ニューロンが存在するスライスを選択してください。脳室帯全体に広がる放射状グリア細胞の微細な蛍光突起が確認できれば、移動中のニューロンが利用する放射状グリア足場が維持されていることを示しています。選択したスライスが入ったメンブレンインサートを、2 mLのスライス培養液を含む直径50 mmのガラス底ディッシュに移します。ディッシュを共焦点顕微鏡のクライメートチャンバーに設置します。解像度を512×512ピクセルに設定します。フレームレートを約1.4 fpsから約2.5 fpsに上げるため、スキャン速度を400 hertzから700 hertzに上げます。平均化回数は2回以内に設定してください。ステップサイズ1.5 micronsで、電気穿孔領域をカバーするZスタックを定義します。30分ごとにZスタックを取得し、タイムラプスシリーズを開始します。記載された設定により、画像取得中の光損傷を低く抑えつつ、十分な解像度と明るさを確保できます。この動画では、E16.5の皮質ニューロンが脳室下帯から皮質板へと移動する様子を示しています。Bcl11a floxed 条件付トランスジェニックマウスにおいて、胚齢14.5日にIRES-GFPコントロールプラスミドをエレクトロポレーションした様子。この動画は1秒間に5フレームの割合で、計108フレームで構成されている。スケールバーは100 micronsを示す。Cre-IRES-GFPを含むDNAプラスミドベクターのエレクトロポレーションにより、Bcl11aを条件付きでfloxした脳における皮質ニューロンの遊走が影響を受けました。ここに見られるように、中間帯を越えて皮質板に到達するニューロンは極めてわずかです。この動画では、左側のGFP標識コントロールと、右側のBcl11a変異体のニューロンにおける皮質ニューロンの極性化を比較して示しています。Bcl11a変異ニューロンにおける代表的な対照群のアニメーショントレースは、1時間間隔の解像度で撮影したE16.5スライス培養のタイムラプスシリーズから得られたものです。ここでも、左側にコントロール脳のデータを、右側にCre-IRES-GFPをエレクトロポレーションした脳のデータを表示しています。対照群およびBcl11a変異スライス培養から得られたこれら代表的なトレースの集まりからわかるように、Bcl11a変異ニューロンでは、赤色の矢印で示されるように、移動速度の低下とランダムな方向転換が繰り返される局面が頻繁に認められます。速度プロファイルは、遊走するニューロンのトレースから算出できます。ここで示されているように、コントロールと比較して、Bcl11a変異ニューロンでは遊走速度がより遅いニューロンの割合が高くなっています。偏差角はトレースデータから算出可能です。このヒストグラムからわかるように、黒いバーで示されるBcl11a変異ニューロンは、コントロールと比較してより大きな偏角を示しています。習熟すれば、子宮内電穿孔法と組織培養脳スライスの準備は、それぞれ2時間以内に完了させることができます。本手法は、機能獲得および機能喪失による放射状遊走皮質ニューロンにおける標的遺伝子の分画解析や、血管実験にも容易に適応させることが可能です。このビデオを視聴することで、エレクトロポレーションを施した胚性脳から作製したオルガノタイプスライス培養において、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて放射状に遊走するニューロンを直接観察する方法について、十分に理解できるはずです。

time-lapse-confocal-imaging-migrating-neurons-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、末梢神経突起伸長の栽培とタイムラプスイメージングのための妊娠中期のマウス胚の器官型スライスを準備する方法を提示する。...

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。...

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

出典: Wiegreffe, C., et. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain using In Utero エレクトロポレーション. J. Vis. Exp. (2017)...

形質導入マウス胚脳切片における皮質ニューロン放射状移動のタイムラプスイメージング

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

神経前駆有糸分裂は、神経新生の重要なパラメータである。神経前駆糸分裂の我々の理解の多くは、固定された組織の分析に基づいている。胚性脳スライス内のライブイメージングは​​、制御された環境で、高い時間·空間分解能で有糸分裂を評価するための汎用的な手法である。...

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

ここでは、海馬の発達における特定の遺伝子の制御メカニズムを調べるためのツールを提供するプロトコルを提示します。子宮外エレクトロポレーションと器官型スライス培養を用いることで、単一細胞における目的遺伝子の発現をアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションし、発生中の遺伝子の運命を追うことができます。...

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で...

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶマウス胚脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング法。ウテロ電気穿孔を用いて遺伝子発現を操作し、新皮質発達における神経細胞の極性形成と移動の分子メカニズムを動的に解析する強力なツールです。

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング

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