Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

L'obiettivo generale di questa procedura è generare pellet condrogenici da cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal sangue del cordone ombelicale. Con questo protocollo, possiamo generare una quantità relativamente grande di pellet condrogenici. I pellet condrogenici generati possono essere utilizzati per studi o modellizzazione di malattie, screening di farmaci e ricercatori in medicina per approfondire la nostra comprensione della natura della cartilagine.

L'anno scorso la cartilagine umana è stata in ritardo per la riparazione. Pertanto, la degenerazione della cartilagine deve essere trattata con un trattamento conservativo. Con un'auto-rinnovabilità illimitata e una multipotenza, le iPSC umane sono state evidenziate come nuova fonte di cellule sostitutive per la riparazione della cartilagine.

A dimostrare la procedura saranno Eugene Nam e Arie Alice Ream, studenti laureati nel mio laboratorio. Per iniziare il protocollo, raccogliere le cellule del sangue in una provetta conica da 15 millilitri e contarle utilizzando un emocitometro. Preparare tre volte da 10 a 5 celle e centrifugarle per cinque minuti a 515 volte G a temperatura ambiente.

Scartare il surnatante per aspirazione e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di terreno cellulare del sangue. Quindi, trasferire le cellule in un pozzetto su una piastra non rivestita a 24 pozzetti e aggiungere la miscela di virus Sendai seguendo le raccomandazioni del produttore. Centrifugare la piastra per 30 minuti a 1, 150 volte G e 30 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, incubare le cellule per una notte. Il giorno successivo, trasferire le cellule di traude in una matrice ben codificata. Centrifugare la piastra.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, aggiungere un millilitro di terreno iPSC e mantenere le cellule. Cambia il terreno ogni giorno e sostituiscilo con un terreno iPSC fresco. Mantenere le cellule staminali pluripotenti indotte umane, o HIPSC.

Cambia il mezzo ogni giorno, sostituendolo con un nuovo otto essenziale o un medio E8. Preparare due volte da 10 a 6 in un mezzo codificato con vitronectina da 100 millilitri ed E8. Quindi, rimuovere il terreno E8 dalla piastra di coltura e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato sterile, o PBS.

Aggiungere un millilitro di un millimolare di EDTA e incubare la capsula per due minuti. Quindi raccogliere le cellule con tre millilitri di terreno E8 e trasferirle in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 250 volte G a temperatura ambiente per due minuti.

Aspirare il surnatante senza disturbare il palato cellulare e risospendere le cellule in cinque millilitri di terreno E8. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, preparare due volte 10 o 6 cellule per ogni piastra di Petri da 100 millimetri. Risospendere le cellule preparate in una miscela da 10 millilitri uno a uno di terreno E8 ed EB, con carnasi associata a 10 file micromolari o inibitore della roccia.

Incubare le cellule durante la notte per l'aggregazione. Il giorno successivo, raccogliere gli EB aggregati mediante pipettaggio. Rimuovere il surnatante e risospendere gli EB in 10 millilitri di terreno E8 fresco.

Ingrandisci gli EB generati per cinque giorni, eseguendo le modifiche giornaliere con il terreno E8 fresco. Per un'ulteriore maturazione, cambiare il terreno di coltura in terreno E7. Mantenere gli EB a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per altri cinque giorni, eseguendo cambi di terreno giornalieri con terreno E7 fresco.

Aggiungere sei millilitri di gelatina all'1% in un piatto da 100 millimetri e incubare il piatto per 30 minuti. Togliere la gelatina e asciugare completamente questo piatto per due o tre ore prima dell'uso. Trasferire gli EB in una provetta conica da 50 millilitri.

Lasciare che gli EB si depositino sul fondo del tubo conico. Rimuovere il surnatante senza disturbare gli EB. Successivamente, risospendere gli EB in 10 millilitri di terreno uguale uguale modificato di shilbecco preriscaldato, o DMEM, con il 20% di siero a bulbo fetale, o FBS.

Trasferire gli EB nella gelatina in un piatto da 100 millimetri. Aggiungere 10 micromolari di inibitore della roccia. Incubare e mantenere le cellule per sette giorni.

Cambia il mezzo a giorni alterni senza aggiungere un inibitore di roccia. Aspirare il terreno di coltura dal piatto. Applicare immediatamente un millilitro di EDTA millimolare sulla piastra e incubare le cellule per due minuti.

Successivamente, raccogli le cellule utilizzando cinque millilitri di DMEM con il 20% di FBS e trasferiscile in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle per due minuti a 250 volte G, a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM con il 20% di FBS.

Filtrare e scartare i grumi di cellule utilizzando un colino cellulare da 40 micrometri e raccogliere le singole cellule. Contare le singole cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare le cellule.

Rimuovere il surnatante e seminare tre volte da 10 a 5 cellule per pellet in un tubo conico da 15 millilitri con 300 microlitri di terreno di differenziazione condrogenico, o CDM. Per la formazione del pellet, centrifugare le cellule, quindi incubare le cellule durante la notte. Entro tre giorni, i pellet mostreranno morfologie sferoidali appiattite.

Mantenere i pellet per 21 giorni. Prima di incorporare, preparare e sciogliere la paraffina a 58 gradi Celsius. Fissare i pellet in un millilitro di paraformaldeide al 4% per due ore a temperatura ambiente in un tubo da 1,5 millilitri.

Posizionare uno strato di garza sulla cassetta e trasferire i pellet fissati utilizzando una pipetta. Coprire il pellet piegando la garza e chiudendo il coperchio della cassetta. Iniziare la disidratazione in 100 millilitri di etanolo al 70%.

Disidratare i pellet attraverso lavaggi di terminazione sequenziali in etanolo all'80% e al 95%. Trasferire in pellet al 100% di etanolo per 10 minuti. Per la chiarifica, sostituire la soluzione con una miscela da 100 millilitri uno a uno di etanolo e xilene per 10 minuti.

Quindi, sostituire la soluzione uno a uno con una miscela uno a due di etanolo e xilene per 10 minuti. Eliminare l'etanolo rimanente incubando i pellet in xilene al 100%. Per l'infiltrazione di paraffina, incubare i pellet in miscele sequenziali di xilene e paraffina.

Eseguire l'intero processo di infiltrazione della paraffina a 58 gradi Celsius. Incubare i pellet in 100 millilitri di una miscela due a uno di xilene e paraffina per 30 minuti. Successivamente, scambiare la soluzione con 100 millilitri di una miscela uno a uno di xilene e paraffina e incubare per 30 minuti.

Quindi scambiare la soluzione con 100 millilitri di una miscela uno a due di xilene e paraffina e incubare per 30 minuti. Per l'infiltrazione finale, trasferire i pellet nel primo bagno di paraffina al 100% e incubare il pellet per due ore. Trasferire i pellet nel secondo bagno di paraffina al 100% e incubare per una notte a 58 gradi Celsius.

Il giorno successivo, usa una pinzetta per trasferire delicatamente i pellet in uno stampo. Aggiungere la paraffina allo stampo dall'erogatore di paraffina. Solidificare la paraffina per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Tagliare le sezioni a sette micrometri e trasferire le sezioni sul vetrino. Lasciare asciugare i vetrini per una notte e conservarli a temperatura ambiente fino a quando non sono pronti per l'uso. Prima della differenziazione, le colonie di iPSC erano espanse.

Le iPSC espanse sono state assemblate come EB per avviare la differenziazione. Gli EB generati sono stati attaccati a piastre rivestite di gelatina per indurre la crescita delle cellule. Dopo 21 giorni di differenziazione, sono stati ottenuti piccoli pellet condrogenici simili a perle e utilizzati per un'ulteriore caratterizzazione.

La qualità dei pellet condrogenici è stata valutata istologicamente il giorno 21, con i pellet condrogenici BMSC utilizzati come controllo positivo. L'accumulo di proteine ECM secrete dalle chrondrocite differenziate è stato confermato dal blu di Alcian, nella colorazione con blu di toluiodina. I pellet condrogenici generati da CDMC HIPSC esprimevano un COL2A1 più elevato rispetto ai pellet derivati da CBMSC HIPCs.

L'espressione del collagene di tipo uno, un marcatore per la cartilagine fibrotica, era inferiore nei pellet derivati da CBMC HIPSC rispetto all'espressione di COL2A1. L'espressione genica delle proteine della matrice extracellulare della cartilagine sui pellet condrogenici del giorno 21 è stata confermata mediante PCR in tempo reale. L'espressione di aggracan dei pellet derivati da CBMC HIPSC era simile a quella dei pellet derivati da BMSC.

Abbiamo fornito un metodo dettagliato per la differenziazione di iPSC derivate da cellule mononucleate del sangue del cordone ombelicale in pellet cronogenici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due mesi se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare pellet condrogenici dalle iPSC.