השתלת intrasplenic של Hepatocytes לאחר Hepatectomy חלקית ב במנוד ראש. SCID עכברים

לטיפול בחולים הסובלים מאי ספיקת כבד חריפה, השתלת הפטוציטים היא אלטרנטיבה להשתלת איברים שלמים. כריתת כבד חלקית משמשת כטכניקה ליצירת AHF. חוץ מזה, הוא משמש גם לחקירת השתלת תאים והתפשטות במהלך טיפול מבוסס תאים.

עכבר הוא אחד המודלים הנחקרים ביותר לביצוע כריתת כבד למטרות כאלה. בסרטון זה נציג הליך לכריתת כבד חלקית ואחריו השתלת הפטוציטים בטחול של NOD. עכבר SCID.

לפני שתתחיל ודא שיש לך את האישור הדרוש מוועדת האתיקה המתאימה לבעלי חיים לביצוע הניסוי. בהליך זה נבצע שני חתכים קטנים. החתך הראשון מיועד לכריתת כבד חלקית באורך של כסנטימטר אחד שנעשית ממש מתחת ל-xiphoid כדי לחשוף את הכבד.

להשתלת תאים נעשה חתך נוסף קטן יותר בחלק הצדדי השמאלי כדי לחשוף את הטחול של החיה. היתרונות הם שזה מוביל לפחות טראומה וכאב לבעל החיים, התאוששות מהירה יותר וכמעט מאה אחוז הישרדות. יתר על כן, הליך זה אינו דורש מיומנויות כירורגיות מיוחדות וניתן להשלים אותו במהירות תוך חמש עד שבע דקות.

בסרטון זה נדגים השתלה של תאים דמויי הפטוציטים הנקראים NeoHep והפטוציטים שבודדו מעכבר GFP טרנסגני ב-NOD שעבר טקטומיקה חלקית. עכבר SCID. ההליך אינו מגביל את סוג התאים להשתלה.

כל כלי הניתוח וה-PBS נוקו אוטומטית כראוי ונשמרו מוכנים לפני הניתוח. שקלו את העכבר. הנהון. עכבר SCID בגיל שישה עד שמונה שבועות במשקל של בין ארבעה עשר לשמונה עשר גרם כלולים בהליך זה.

לגלח את החלק המרכזי, העליון והשמאלי של בטן העכבר. על מנת להסיר שיער קצוץ, יש למרוח קרם להסרת שיער על האזור המגולח. יש להמתין ארבע עד חמש דקות ולהסיר את השיער בעדינות.

פתח את נעילת שסתום בלון החמצן. הנח את העכבר בתא האיזופלורן. התאם את זרימת החמצן בארבעה ליטר לדקה.

התאם את אידוי האיזופלורן בארבעה אחוזים להשראת ההרדמה. ודא שהעכבר הורדם כראוי על ידי צביטה עדינה של הבוהן. הנח לוח ניתוח בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

הנח את החיה על לוח הניתוחים כך שהחלק הגחוני של העכבר פונה כלפי מעלה והחלק הקדמי של העכבר ממוקם בתוך חרוט האף המחובר לאיזופלורן ולאספקת החמצן. הפחת את אידוי האיזופלורן לשני אחוזים לשמירה על ההרדמה. לחטא את העור על ידי ניגובו בכותנה סטרילית ספוגה בשבעים אחוז אתנול.

בצע חתך רוחבי של כסנטימטר אחד בעור ממש מתחת לעצם החזה בניצב ל-xiphoid במקביל לכלוב הצלעות. הפרד בעדינות את העור והצפק ליד החתך. בצע חתך רוחבי דרך שכבת הצפק ממש מתחת לקיפואיד כדי לחשוף את האונה השמאלית של הכבד.

ישתמשו בשני קצה כותנה לח. הניחו את אחד מקצות הכותנה בצד הבטן של החתך והניחו קצה כותנה נוסף בצד הסרעפת. כעת לחץ בעדינות על הקצה המונח לכיוון הסרעפת ותן דחיפה מחליקה בקצה השני כדי להרים את האונה השמאלית של הכבד.

הניחו לולאה של חוט משי על בסיס האונה הצדדית השמאלית קרוב להילום הכבד באמצעות מלקחיים מיקרו-ניתוחים. לאחר סגירת הקשר מעט, החלק את חוט המשי ככל האפשר לבסיס אונת הכבד. הדק את הקשר והניח שני קשרים נוספים בצד השני.

חותכים את האונה הקשורה בעזרת מספריים מיקרו-כירורגיים. תמונה זו מציגה את החלק הנותר של האונה השמאלית לאחר הכריתה. תפר את הצפק על ידי תפירה רציפה עם תפר נספג של ארבע אפס Catgut.

סגור את העור על ידי תפירה לא רציפה או קטועה באמצעות אותם תפרים נספגים של ארבעה אפס Catgut. מרחו בטדין בקרבת תפרים. שמור את הפטוציטים או ה-NeoHep תלויים בחמישים מיקרו-ליטר IMDM מוכנים במזרק אינסולין של מ"ל אחד עם מחט בגודל עשרים ותשע.

הנח את העכבר כך שהחלק הצדדי השמאלי יפנה כלפי מעלה. זהה את אזור הטחול ונתח את העור לרוחב. ערוך חתך של שניים עד שלושה מילימטרים בשכבת הצפק כדי לחשוף את הטחול.

הניחו את הטחול בין שני קצות כותנה לחים והרימו אותו בעדינות. חודרים את המחט בקליפת הטחול בעדינות ומשחררים את תרחיף התאים לטחול. סגור את הצפק על ידי תפירה רציפה עם תפר ארבע אפס וסגור את העור על ידי תפירה לא רציפה.

מרחו בטדין על תפרים. יש להזריק מאה מיקרו ליטר מלח תוך צפקי המכיל 12 מיליגרם אנטיביוטיקה Cefotaxime. יש להזריק מאה מיקרו ליטר מלח תוך צפקי המכיל שנים עשר מיקרוגרם של מלוקסיקם משכך כאבים.

זה יינתן מדי יום במשך שלושה ימים לאחר הניתוח. סגור את מכשיר האידוי איזופלורן והנח את העכבר בכלוב. החיה תשיג הכרה תוך שניות.

התפשטות הפטוציטים בכבד לאחר עשרים וארבע שעות של כריתת כבד של שלושים אחוז נבדקה על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית של חלקי כבד עם Ki-67 שהוא סמן התפשטות תאים. לאחר צביעת קטעים אלה באנטי-Ki-67 חזרת, נעשה שימוש בנוגדנים משניים מצומדים לגילוי ודי-אמינו בנזדין שימש כמצע לפיתוח צבע חום. הגרעין היה מוכתם נגדית בהמטוקסילין.

בתמונה זו תאים בצבע חום הם הפטוציטים חיוביים ל-Ki-67. עשרה ימים לאחר ההשתלה העכבר הורדם והכבד נבדק. תמונה מייצגת מוצגת כאן.

מהכבד המחודש נכרתו האונה הצדדית הימנית, האונה המדיאלית הימנית והאונות המדיאליות השמאליות והתקבלו חמישה חתכים מיקרוניים. חלקים אלה הוכתמו בנוגדנים אנטי-GFP רב-שבטיים ראשוניים של ארנב ונוגדנים משניים נגד ארנב Alexa Fluor 594. הגרעין היה מוכתם ב-DAPI.

תמונה זו מציגה את הביות של הפטוציטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק הנראה כאדום. כאשר הושתלו תאים דמויי הפטוציטים ממקור אנושי הנקראים NeoHep, ראינו את הביטוי של אלבומין אנושי וקונקסין 32 אנושי בחלקי הכבד של עכבר הכבד המקבל. עשרה ימים לאחר הניתוח הניתוח הביוכימי של אנסימות המופרשות בכבד בסרום אישר כי רמות האספרטט אמינוטרנספראז, אלנין אמינטרנספראז ופוספטאז אלקליין הוחזרו לנורמה.

באופן דומה, הבדיקה ההיסטולוגית של חתכי כבד על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין לא הראתה חריגות עשרה ימים לאחר הניתוח, מה שמעיד על התאוששות תקינה של הכבד. חשוב לנקוט בכמה אמצעי זהירות. נסה למקם את קשר חוט הניילון בבסיס אונת הכבד.

אל תשכח לעשות שני קשרים הדוקים נוספים בצד הנגדי ואל תנסה לחתוך קרוב מאוד לחוט. להשתלת תאים בטחול, חודרים את המחט בדיוק אנכית והיא לא צריכה להעמיק יותר משני מילימטרים. לסגירת העור יש להימנע משימוש בקליפסים לפצעים.

במקום זאת סגור אותו בתפר של ארבע אפס. קליפסים פצועים מגבילים את התנועה הטבעית של העכבר ולעתים קרובות קליפסים משתחררים ויוצאים תוך זמן קצר. לאחר החזרת החיה לכלוב, אתה יכול להניח כמה חתיכות של פתיתי תירס סטריליים בכלוב ולספק מים סטריליים עם חמישה אחוזי גלוקוז.

אם אין לך חשיפה מוקדמת יותר לניתוחים בבעלי חיים, תרגל בנפרד את כריתת הכבד החלקית וההשתלה בעכברים רגילים בעלי יכולת חיסונית ולאחר מכן בצע את שני התהליכים בבעל חיים אחד. בצע את ההליכים ב-NOD חסר חיסון. עכבר SCID, רק לאחר השגת שיעור הישרדות של מאה אחוז בעכברים בעלי יכולת חיסונית.