Hepatositlerin intrasplenic nakli düğümde kısmi Hepatectomy sonra. SCID fareler

Akut karaciğer yetmezliği olan hastaların tedavisinde hepatosit nakli tüm organ transplantasyonuna bir alternatiftir. Parsiyel hepatektomi, AHF oluşturmak için bir teknik olarak kullanılır. Ayrıca, hücre bazlı tedavi sırasında hücre engraftmanı ve proliferasyonunu araştırmak için de kullanılır.

Fare, bu tür amaçlar için hepatektomi yapmak için en çok araştırılan modellerden biridir. Bu videoda parsiyel hepatektomi için bir prosedür göstereceğiz ve ardından bir NOD dalağında hepatositlerin nakli yapılacak. SCID fare.

Başlamadan önce, deneyi gerçekleştirmek için uygun hayvan etik kurulundan gerekli onayı aldığınızdan emin olun. Bu işlemde iki küçük kesi yapacağız. İlk kesi, karaciğeri açığa çıkarmak için ksifoidin hemen altında yapılan yaklaşık bir santimetre uzunluğunda olacak kısmi karaciğer hepatektomisi içindir.

Hücrelerin nakli için, hayvanın dalağını ortaya çıkarmak için sol yan kısımda daha küçük bir kesi yapılır. Avantajları, hayvanda daha az travma ve acıya, daha hızlı iyileşmeye ve neredeyse yüzde yüz hayatta kalmaya yol açmasıdır. Ayrıca, bu prosedür herhangi bir özel cerrahi beceri gerektirmez ve beş ila yedi dakika içinde hızlı bir şekilde tamamlanabilir.

Bu videoda, NeoHep adı verilen hepatosit benzeri hücrelerin ve transgenik GFP faresinden izole edilen hepatositlerin kısmen hepatektomize NOD içinde transplantasyonunu göstereceğiz. SCID fare. Prosedür, nakil için hücre tipini kısıtlamaz.

Tüm cerrahi aletler ve PBS usulüne uygun olarak otomatik olarak temizlendi ve ameliyattan önce hazır tutuldu. Fareyi tartın. NOD. Ağırlığı on dört ila on sekiz gram arasında olan altı ila sekiz haftalık SCID faresi bu işleme dahil edilir.

Fare karnının orta, üst ve sol kısmını tıraş edin. Kesilen tüyleri almak için, tıraş edilen bölgenin üzerine tüy dökücü krem sürün. Dört ila beş dakika bekleyin ve tüyleri nazikçe alın.

Oksijen tüpü valfinin kilidini açın. Fareyi Isofluran odasına yerleştirin. Oksijen akışını dakikada dört litre olarak ayarlayın.

Anesteziyi indüklemek için izofluran buharlaşmasını yüzde dörtte ayarlayın. Ayak parmağınızı hafifçe kıstırarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olun. Biyogüvenlik kabininin içine bir ameliyat tahtası yerleştirin.

Hayvanı, farenin ventral kısmı yukarı bakacak ve farenin ön kısmı İzofluran ve oksijen kaynağına bağlı burun konisinin içine yerleştirilecek şekilde ameliyat tahtasına yerleştirin. Anesteziyi sürdürmek için İzofluran buharlaşmasını yüzde ikiye düşürün. Cildi yüzde yetmiş etanole batırılmış steril pamukla silerek dezenfekte edin.

Göğüs kafesine paralel olarak ksifoid'e dik olan sternumun hemen altındaki deride yaklaşık bir santimetrelik enine bir kesi yapın. Kesi yakınındaki cildi ve peritonu nazikçe ayırın. Karaciğerin sol lobunu ortaya çıkarmak için ksifoidin hemen altındaki periton tabakasından enine bir kesi yapın.

İki adet nemli pamuk ucu kullanılacaktır. Pamuk uçlardan birini kesimin karın tarafına yerleştirin ve diyafram tarafına başka bir pamuk ucu yerleştirin. Şimdi diyaframa doğru yerleştirilen ucu hafifçe bastırın ve karaciğerin sol lobunu kaldırmak için diğer uçla kayarak itin.

Mikro diseksiyon forsepslerini kullanarak sol lateral lobun tabanına, karaciğer hilusuna yakın bir ipek iplik halkası yerleştirin. Düğümü hafifçe kapattıktan sonra, ipek ipliği mümkün olduğunca karaciğer lobunun tabanına kaydırın. Düğümü sıkın ve diğer tarafa iki ek düğüm yerleştirin.

Bağlı lobu bir mikrocerrahi makası kullanarak kesin. Bu görüntüde rezeksiyon sonrası sol lobun kalan kısmı görülmektedir. Dört sıfır Catgut emilebilir sütür ile sürekli dikiş atarak peritonu dikin.

Aynı dört sıfır Catgut emilebilir sütür kullanarak kesintili veya kesintili dikiş atarak cildi kapatın. Betadine'i dikişlerin yakınında uygulayın. Hepatositleri veya NeoHep'i elli mikro litrelik IMDM'de asılı halde yirmi dokuz gauge iğne ile bir ML insülin şırıngasında hazır tutun.

Fareyi sol yan kısım yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Dalak bölgesini tanımlayın ve cildi enine inceleyin. Dalağı ortaya çıkarmak için periton tabakasında iki ila üç milimetrelik bir kesim yapın.

Dalağı iki nemli pamuk ucu arasına yerleştirin ve yavaşça kaldırın. Dalak korteksindeki iğneyi nazikçe delin ve hücre süspansiyonunu dalağın içine bırakın. Dört sıfırlı dikiş ile sürekli dikiş atarak karın zarını kapatın ve kesintili dikiş atarak cildi kapatın.

Betadine'i dikişlere uygulayın. On iki miligram antibiyotik Sefotaksim içeren intraperitoneal olarak yüz mikro litre salin enjekte edin. On iki mikro gram analjezik Meloksikam içeren intraperitoneal olarak yüz mikro litre salin enjekte edin.

Bu, ameliyattan sonraki üç gün boyunca günlük olarak verilmelidir. İzofluran buharlaştırıcıyı kapatın ve fareyi kafese yerleştirin. Hayvan saniyeler içinde bilinç kazanacaktır.

Yüzde otuz hepatektomiden yirmi dört saat sonra karaciğerdeki hepatositlerin proliferasyonu, hücre proliferasyon belirteci olan Ki-67 ile karaciğer kesitlerinin immünohistokimyasal boyanması ile incelendi. Bu bölümler anti-Ki-67 yaban turpu ile boyandıktan sonra, tespit için peroksidaz konjuge ikincil antikor kullanıldı ve kahverengi renk geliştirmek için substrat olarak Di-Amino Benzadin kullanıldı. Çekirdek hematoksilen ile karşı boyandı.

Bu görüntüde, kahverengi renkli hücreler Ki-67 pozitif çoğalan hepatositlerdir. Transplantasyondan on gün sonra fareye ötenazi yapıldı ve karaciğer incelendi. Burada temsili bir resim gösterilmektedir.

Rejenere karaciğerden sağ lateral lob, sağ medial lob ve sol medial loblar eksize edildi ve beş mikronluk kesitler elde edildi. Bu kesitler primer tavşan poliklonal anti-GFP ve sekonder anti-tavşan Alexa Fluor 594 antikorları ile boyandı. Çekirdek DAPI ile boyandı.

Bu görüntü, kırmızı olarak görülebilen yeşil floresan proteini eksprese eden hepatositlerin hedef kitlesini göstermektedir. NeoHep adı verilen insan kaynaklı hepatosit benzeri hücreler nakledildiğinde, alıcı hepatektomize farenin karaciğer bölümlerinde insan Albumini ve insan Connexin 32'nin ekspresyonunu gözlemledik. Ameliyattan on gün sonra, serumda karaciğer salgılanan ensymes'in biyokimyasal analizi, aspartat aminotransferaz, alanin amintransferaz ve alkalin fosfataz seviyelerinin normale döndüğünü doğruladı.

Benzer şekilde, hematoksilen ve eozin boyama ile karaciğer bölümlerinin histolojik incelemesi, ameliyattan on gün sonra karaciğerin uygun şekilde iyileşmesini gösteren herhangi bir anormallik göstermedi. Birkaç önlem almak önemlidir. Naylon iplik düğümünü karaciğer lobunun tabanına yerleştirmeye çalışın.

Karşı tarafa iki ek sıkı düğüm atmayı unutmayın ve ipliğe çok yakın kesmeye çalışmayın. Hücreleri dalağa nakletmek için, iğneyi tam olarak dikey olarak delin ve iki milimetreden daha derine inmemelidir. Cildi kapatmak için yara klipsleri kullanmaktan kaçının.

Bunun yerine dört sıfırlı bir dikişle kapatın. Yara klipsleri farenin doğal hareketini kısıtlar ve genellikle klipsler gevşer ve kısa sürede çıkar. Hayvanı tekrar kafese yerleştirdikten sonra, kafese birkaç parça steril mısır gevreği yerleştirebilir ve yüzde beş glikozlu steril su sağlayabilirsiniz.

Daha önce hayvan cerrahisine maruz kalmadıysanız, normal immüno-kompetan farelerde kısmi karaciğer hepatektomi ve transplantasyonu ayrı ayrı uygulayın ve ardından her iki prosedürü de tek bir hayvanda gerçekleştirin. İmmün yetmezliği olan NOD'da prosedürleri gerçekleştirin. SCID fare, sadece immüno-kompetan farelerde yüzde yüz hayatta kalma oranına ulaştıktan sonra.