Name: Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprende el protocolo ChIP para muestras embrionarias de baja abundancia en Gallus gallus. Este método permite generar perfiles epigenómicos globales y estudiar modificaciones de histonas en tejidos embrionarios limitados.

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Los autores agradecen a Jan Appel por su excelente asistencia técnica durante el establecimiento de este protocolo. Trabajo en el laboratorio de Rada-Iglesias es apoyado por CMMC intramuros financiación, becas de investigación de la DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 y TE 1007/3-1), el investigador avanzado UoC grupo Grant y la beca del CECAD.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen sus intereses financieros que compiten a ser revelada.

Epigenómica perfiles de modificación de las histonas con ChIP-seq pueden utilizarse para mejorar la anotación funcional de genomas vertebrados en diferentes contextos celulares4,5,18. Estos perfiles epigenómica pueden utilizarse, entre otras cosas, para identificar elementos de reforzador, para definir el estado regulador de potenciadores (es decir, activo, preparado, o preparada) y definir los reguladores de identidad ...

Modificaciones post-traduccionales de las histonas están directamente involucradas en diversos procesos dependiente de la cromatina, incluyendo transcripción, replicación y reparación de ADN1,2,3. Además, modificaciones de las histonas diferentes muestran positivos (por ejemplo, H3K4me3 y H3K27ac) o negativo (por ejemplo, H3K9me3 y H3K27me3) correlaciones con la expresión de genes y puede ser definido ampliamente como marcas de activación o represión de la histona, respectivamente2,3. En consecuencia, los mapas de modificación global de la histona, también conocidos como mapas epigenómicos, han surgido como herramientas poderosas y universales para funcionalmente anotar genomas vertebrados4,5. Por ejemplo, secuencias reguladoras distales como potenciadores pueden ser identificados basan en la presencia de firmas de cromatina específicos (por ejemplo, activos potenciadores: H3K4me1 y H3K27ac), que distinguen de las regiones del promotor proximal (por ejemplo, promotores activos: H3K4me3)6,7,8. Por otra parte, los genes con funciones reguladoras de la identidad de células grandes suelen encontrarse con dominios de cromatina amplio marcados con H3K4me3 o H3K27me3, dependiendo del estado transcripcionalmente activo o inactivo de los genes subyacentes, respectivamente9 ,10. Del mismo modo, la expresión de los genes de identidad principales de la célula parece ser controlados con frecuencia por múltiples y espacialmente agrupados potenciadores (es decir, súper potenciadores), que pueden ser identificados como amplios dominios marcados H3K27ac11.
En la actualidad, histona modificación mapas son generados usando la tecnología de ChIP-seq, que en comparación con los anteriores enfoques como ChIP-chip (ChIP juntada a microarrays) proporciona mayor resolución, menos artefactos, menos ruido, mayor cobertura y menor cuesta12. Sin embargo, la generación de los mapas epigenómicos utilizando la tecnología de ChIP-seq tiene sus limitaciones inherentes, sobre todo asociadas a la capacidad para realizar con éxito el ChIP en las muestras de interés. Protocolos de ChIP tradicionales típicamente requieren millones de células, que limitan la aplicabilidad de este método a celular in vitro de líneas o células que puede ser fácilmente aisladas en vivo (por ejemplo, las células de sangre). En los últimos años, un número de protocolos modificados de ChIP compatibles con un número bajo de células ha sido descritas13,14,15,16. Sin embargo, estos protocolos están diseñados para acoplarse con secuenciación de próxima generación (es decir, ChIP-seq), y por lo general utilizan ad hoc biblioteca preparación métodos13,14, 15 , 16.
Aquí, hemos descrito un protocolo de ChIP que puede utilizarse para investigar perfiles de modificación de histonas mediante un número bajo a intermedio de células (5 x 104 - 5 x 105 células) en cualquiera de los dos loci seleccionados (es decir, ChIP-qPCR) o global (, es decir, ChIP-seq) (figura 1). Cuando se acopla a la tecnología ChIP-seq, nuestro protocolo de ChIP puede utilizarse junto con métodos de preparación de la biblioteca estándar, por lo que es ampliamente accesible a muchos laboratorios10. Este protocolo se ha utilizado para investigar varias marcas de histona (p. ej., H3K4me3, H3K27me3 y H3K27ac) en los tejidos embrionarios de pollo diferentes (p. ej., tubo neural espinal (SNT), prominencias frontonasal y epiblasto). Sin embargo, esperamos que sea ampliamente aplicable a otros organismos en que biológicamente o clínicamente relevantes muestras pueden obtenerse solamente en cantidades bajas.

<table><tbody><tr><td><reactivo fuerte>reactivo</polvo ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td> fuerte <td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-desoxicolato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G/perlas magnéticas</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasa</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-butirato</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>Inhibidor de la proteinasa</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb escalera</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Naranja</td><td>G Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Etoxilato de octilfenol (Tritón x 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&agudo; s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de carga de gel Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Placas</td><td>Sarstedt</td><td>721.985.202</td><td></td></tr><tr><td>384 pozo</td><td>Sarstedt</td><td>721.985.202</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1.000 &micro; L Puntas de filtro</td><td>Sarstedt</td><td>70.762.211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &micro; L Puntas de filtro</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &micro; L Puntas de filtro</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0.5 - 10 &micro; L Puntas de filtro</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K27me3</td><td>Motivo Activo</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K27ac</td><td>Motivo Activo</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K4me3</td><td>Motivo Activo</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K4me2</td><td>Motivo Activo</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla Reparadora Final</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Perlas paramagnéticas</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de resuspensión</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de cola</td><td>A Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de ligadura</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr> Índice adaptador de <tr><td>ARN</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ligadura de parada</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de cebadores para PCR</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de PCR mejorada</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN genómico</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de elución</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestras</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td> <td>de cuantificación de bibliotecasKapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>Huevos blancos de gallina fértiles</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>Aguja (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Active Motive</td><td>EpiShear sonicador</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>Rotador</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Volumen variable (5 &ndash; 1.000 &mu; L) pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>Giratorio de mesa</td><td>Heathrow Scientific</td><td></td> Sprout <td></td></tr><tr><td>Mixer</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Cycler</td><td>Roche</td><td>Light Cycler; Nº de serie 5662</td><td></td></tr><tr><td>Ciclador de PCR Applied</td><td>Biosystems</td><td>Gene Amp Sistema de PCR 9700</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de control de calidad de ADN y ARN</td><td>Agilent Agilent</td><td>4200 Sistema</td><td></td>TapeStation</tr><tr><td>Pinzas</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>Cuchara perforada</td><td>World Instrumentos de precisión 501997</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cromatina (chip) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica ampliamente utilizada para el mapeo de la localización de modificación postraduccional de las histonas, variantes de las histonas, factores de transcripción o enzimas modificadores de la cromatina en un locus determinado o en una escala genoma-ancha. La combinación de ensayos de ChIP con secuenciación de próxima generación (es decir, ChIP-Seq) es un enfoque poderoso para descubrir todo el mundo redes reguladoras del gene y para mejorar la anotación funcional del genoma, especialmente de secuencias reguladoras no codificantes. Protocolos de chIP normalmente requieren grandes cantidades de material celular, así que la aplicabilidad de este método a la investigación de tipos raros de la célula o biopsias de tejido pequeño. Para hacer el ensayo de ChIP compatible con la cantidad de material biológico que se puede obtener normalmente en vivo durante la embriogénesis temprana de vertebrados, se describe aquí un protocolo simplificado de ChIP en el que el número de pasos necesarios para completar la ensayo fueron reducidas para minimizar la pérdida de muestra. Este protocolo de ChIP se ha utilizado con éxito para investigar modificaciones de las histonas diferentes en varios embrionario pollo y ratón adulto tejidos utilizando baja a un número medio de células (5 x 104 - 5 x 105 células). Lo importante, este protocolo es compatible con la tecnología ChIP-seq con métodos de preparación de la biblioteca estándar, proporcionando epigenómica global mapas en tejidos embrionarios muy relevantes.

Para ilustrar el funcionamiento de nuestro protocolo de viruta, se realizaron experimentos utilizando secciones SNT agrupadas de embriones de pollo de HH19, las prominencias maxilares de HH22 pollo embriones y embriones de pollo HH3 etapa para investigar los perfiles de unión de ChIP-seq varias modificaciones de las histonas (es decir, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 y H3K27me3). Una vez que se obtuvieron ADNs de viruta, se evaluó la eficacia de la sonicación por electroforesis del gel...

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar los perfiles de unión de diferentes modificaciones de histonas, utilizando muestras embrionarias de baja abundancia para mejorar la anotación funcional de los genomas de los vertebrados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como cuáles son los potenciadores clave y los genes que definen la identidad de un tejido embrionario en particular. Las principales ventajas de estas técnicas son que requiere una cantidad limitada de material particular y también se puede utilizar tanto para análisis específicos locales como para análisis de todo el genoma.Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación de la transcripción o la heterogeneidad celular con los tejidos embrionarios, también se puede aplicar a otros sistemas, como las muestras de patentes. Para obtener la etapa HH19, los embriones de gallina para este experimento, incubaron huevos fértiles de gallina Leghorn blanca en orientación horizontal a 37 grados centígrados y 80% de humedad durante tres días. Para empezar a aislar los embriones de HH19, hazlos accesibles extrayendo tres mililitros de albúmina con una jeringa de 10 milímetros para bajar el blastodermo.Con el fin de eliminar las membranas embrionarias adicionales, use tijeras finas para hacer una pequeña abertura en el ojo. Agregue un mililitro de solución de bloqueo. Con la ayuda de una aguja doblada, añade 0,5 mililitros de tinta negra china.Use tijeras quirúrgicas finas y pinzas para cortar la membrana embrionaria adicional que rodea al embrión. A continuación, transfiere el embrión con una cuchara perforada a una placa de Petri de 4,5 centímetros que contiene 20 mililitros de solución de PBS. Trabajando en hielo bajo un microscopio estereoscópico, use tijeras finas y pinzas para diseccionar y desechar el amnios y las partes restantes de la membrana embrionaria adicional.A continuación, se corta el tubo neurológico espinal transverso o el segmento SNT a nivel braquial del embrión. Extienda la disección caudalmente en la región torácica para aislar el SNT. Para terminar, utiliza pinzas para extraer los tejidos que rodean lateral y ventralmente el SNT.Después de aislar los SNT, sumerja cada segmento en una placa de Petri de 3,5 centímetros que contenga tripsina tibia a 37 grados centígrados. Cuando el aflojamiento de los tejidos no neurológicos alrededor del SNT sea visible bajo un microscopio estereoscópico, transfiera las muestras a PBS frío 1x. Para detener la tripsinización, transfiera las muestras a un nuevo plato con DMEM frío que contenga 10% de FBS.Use fórceps para extraer manualmente los tejidos mesenquimales y ectodérmicos restantes del SNT. Transfiera esta sección limpia de SNT a un tubo de 1,5 mililitros y congélela rápidamente en nitrógeno líquido. A continuación, homogeneice el tejido según el protocolo de texto.Añadir 13,5 microlitros de formaldehído al 37% e incubar a temperatura ambiente en un rotador durante 15 minutos. Para apagar el formaldehído, agregue 25 microlitros de glicina molar 2.5 molar al tubo e incube a temperatura ambiente en un rotador durante 10 minutos. Centrifugar el tubo y luego, lavar el pellet de acuerdo con el protocolo de texto.Después de la reticulación, vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de tampón de lisis completo y helado por pipeteo. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados en una plataforma oscilante durante 10 minutos. A continuación, sonique las muestras a cuatro grados centígrados.Después de la sonicación, centrifugar las muestras a 16.000 x G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante o lisado a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y deseche la pastilla de residuos celulares. Diluya el lisado de acuerdo con el protocolo de texto.Luego, mantenga una pequeña alícuota de cada muestra como control de entrada y congele a 20 grados centígrados. Incubar las muestras restantes que se someterán a precipitación de cromatina o chip con los anticuerpos apropiados de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, añada 300 microlitros de cromatina unida a anticuerpos a las perlas magnéticas previamente lavadas.Invierta los tubos para mezclar las muestras. Para unir los anticuerpos a las perlas, coloque los tubos en un rotador de tubos y gírelos verticalmente a cuatro grados centígrados durante un mínimo de cuatro horas. Para lavar las perlas unidas con cromatina, agregue un mililitro de tampón de lavado RIPA helado al tubo mantenido en hielo y mezcle invirtiendo o moviendo el tubo.Después de colocar el tubo en el soporte magnético a temperatura ambiente, espere a que las cuentas se asienten en el costado. Vierte el líquido transparente y repite este lavado tres veces más. Después de agregar un mililitro de cloruro de sodio TE 50 milimolar al tubo, transfiera las perlas unidas a la cromatina en esta solución a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 milímetros.Coloque el tubo en el soporte magnético y cuando las perlas se hayan asentado, vierta el líquido. A continuación, centrifugar las perlas a 900 x G a cuatro grados centígrados durante tres minutos en una centrífuga preenfriada. Una vez que las cuentas se hayan asentado en el soporte magnético, retire todo el TE restante con una punta de carga de gel.Trabajando a temperatura ambiente, agregue 210 microlitros de tampón de elución a las perlas y vuelva a suspender agitando. Incube el tubo en un bloque de calor precalentado a 65 grados centígrados durante 15 minutos, mientras agita. Después de la incubación, centrifugar los tubos con las perlas a 16.000 x G a temperatura ambiente, durante un minuto.Una vez que las perlas se hayan asentado en el soporte magnético, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Descongele la muestra de control de entrada previamente congelada desde 20 grados centígrados hasta temperatura ambiente. Agregue 90 microlitros de tampón de elución a la muestra y mezcle mediante un breve vórtice.Para revertir los enlaces cruzados, incube el chip y controle las muestras a 65 grados centígrados durante la noche. Trabajando a temperatura ambiente, agregue un volumen de tampón TE por tubo e invierta para mezclar. Para digerir el ARN, agregue la ARNasa A al control y corte las muestras hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitro e invierta los tubos para mezclar.Incubar los tubos en un bloque de calor precalentado a 37 grados centígrados durante dos horas. Para digerir la proteína para la posterior purificación del ADN, agregue proteasa K hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitros a los tubos e invierta los tubos para mezclar. Incubar los tubos en un bloque de calor precalentado a 55 grados centígrados durante dos horas.Extraiga y purifique el ADN de acuerdo con los materiales complementarios. Este ADN ahora se puede utilizar para la PCR cuantitativa y la preparación de bibliotecas de búsqueda de chips. La eficiencia de la sonicación, esencial para el éxito de un chip, se confirma mediante la electroforesis en gel de agarosa de las muestras de control de entrada.En este ejemplo, utilizando secciones de tubo neural espinal de pollo o SNT, se utilizaron 11 ciclos de sonicación para obtener un tamaño de fragmento óptimo que oscila entre 200 y 500 pares de bases. El ADN astillado se analizó mediante PCR cuantitativa para medir los niveles de enriquecimiento de las marcas de histonas activadoras y represivas alrededor de las regiones promotoras de los genes que están activos e inactivos en el SNT del pollo. Esto demuestra que es posible evaluar la calidad del chip cuantificando solo unos pocos lados bajos sin perder mucho ADN para análisis posteriores.Después de que las bibliotecas de búsqueda de chips se prepararon en secuencia, se muestra una langosta representativa para los datos de búsqueda de trimetilación de H3K27 y trimetilación de H3K4 generados en SNT de pollo. También se generaron con éxito perfiles de búsqueda de chips similares en diferentes tejidos embrionarios de pollo, como prominencias maxilares y embriones en estadio HH3. Esto demuestra que aquí se presenta el protocolo CHIP se puede utilizar para generar perfiles epigenómicos a partir de cantidades limitadas de varios tejidos embrionarios.Al utilizar este protocolo para generar los perfiles de modificación de histonas en un tejido embrionario, es importante recordar que las señales provendrán de todos los diferentes tipos de células presentes en dicho tejido. Siguiendo este protocolo y utilizando más material biológico de partida, debería ser posible investigar los perfiles de unión de otras proteínas implicadas en la regulación transcripcional, como los factores de transcripción, los coactivadores o las subunidades de la ARN polimerasa 2. Una vez establecidos, estos protocolos permitirán a los investigadores en el campo de la biología del desarrollo o la genética médica mejorar la alteración funcional de los genomas de los vertebrados y obtener información importante sobre las bases moleculares de la miogénesis, la evolución y las enfermedades humanas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

La cuestión de cómo los reguladores y los estados de la cromatina cromatina afecta al genoma in vivo es fundamental para nuestra comprensión de cómo los primeros se toman las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Chip-Sec-el método más popular para investigar las características de la cromatina en un nivel se describe aquí mundial para los embriones de Xenopus.

Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones por chip-Sec

Una regulación de puesta a punto de la transcripción génica subyace en la decisión del destino celular embrionaria. En este documento, se describen ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina utilizados para investigar la regulación epigenética de tanto la diferenciación cardiaca de células madre y el desarrollo cardiaco de embriones de ratón.

La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

Este artículo describe un protocolo ChIP-Seq semiautomatizado y microescalado de regiones de ADN asociadas con una modificación específica de histonas (H3K27ac) utilizando una plataforma de manejo de líquidos ChIP, seguida de la preparación de la biblioteca mediante tagmentación. El procedimiento incluye la evaluación de control con fines de calidad y cantidad y puede adoptarse para otras modificaciones de histonas o factores de transcripción.

Un procedimiento ChIP-Seq semiautomatizado para estudios epigenéticos a gran escala

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Aprende el protocolo ChIP para muestras embrionarias de baja abundancia en Gallus gallus. Este método permite generar perfiles epigenómicos globales y estudiar modificaciones de histonas en tejidos embrionarios limitados.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

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