3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

このアッセイの全体的な目標は、全非抗凝固血を使用して、内皮細胞の抗凝固特性を評価することです。この方法は、心臓血管研究、輸送および手術関連研究に関連する研究課題に答えるために使用できます。基本的に、抗免疫と内皮細胞の活性化に関係するすべての質問に使用できます。

この技術の主な利点は、抗凝固剤を使用せずに全血を抗凝固剤として使用できることです。プロトコールを開始するには、7ミリリットルのマイクロキャリアビーズと42ミリリットルの凝固溶液を50ミリリットルのチューブに混合し、ビーズを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、ビーズを25ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで洗浄し、ピペッティングで上下させてビーズをすすぎます。

ビーズがチューブの底に落ち着くまで待ってから、上清を捨てて繰り返します。次に、ビーズを25ミリリットルのダルベッコのモディファイドイーグルスミディアム、DMEMで1回洗います。次に、ビーズを10ミリリットルの培地199で覆い、10分間平衡化してからさらに使用します。

PAECを含むT175フラスコから細胞培養培地を取り出し、5ミリリットルのPBSを加えます。次に、T175フラスコからPBSを取り外し、0.05%EDTAを含む5ミリリットルのトリプシンと交換します。細胞を摂氏37度で3〜4分間インキュベートします。

フラスコを15ミリリットルの細胞培養培地ですすいで細胞を回収し、懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。細胞を遠心分離し、遠心分離後、余分な培地を取り除き、ペレットを5ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁します。細胞懸濁液に20ミリリットルの細胞培養培地を加え、細胞を再懸濁します。

細胞を含まない20ミリリットルの細胞培養培地を500ミリリットルのマグネチックスターラーフラスコに加えます。洗浄したマイクロキャリアビーズに細胞を加え、25ミリリットルの血清ピペットで溶液を慎重に混合します。ビーズセル混合物を磁気スピナーフラスコに移します。

チューブを10ミリリットルの細胞培養培地ですすぎ、残りの細胞を回収します。さらに85ミリリットルの細胞培養培地をスピナーフラスコに加えます。フラスコをインキュベーターに一晩、シェーカーで摂氏37度に置きます。

50ミリリットルの細胞培養培地を添加して、総容量200ミリリットルにします。シェーカーでさらに24時間攪拌を続けます。無色のロックウェルパークメモリアルインスティテュートまたはRPMIメディアを、総容量の320ミリリットルに達するまで追加します。

100時間ごとに100ミリリットルの古いメディアを取り除き、100ミリリットルの新鮮なサプリメント無色のRPMIを追加します。細胞を5〜7日間培養し、細胞被覆ビーズのコンフルエント状態に応じて行います。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、マグネチックスターラーフラスコから細胞コーティングビーズを取り出し、12ミリリットルの丸底ポリプロピレンチューブに移します。

1〜2分後、ビーズが落ち着いたら、余分なメディアを取り除きます。各チューブに正確に2mmのビーズが含まれるまで、チューブにビーズを追加します。次に、各チューブに5ミリリットルの透明RPMIを加え、10ミリリットルの血清ピペットで溶液を慎重に混合します。

ビーズが落ち着くのを待って、余分なメディアを取り除きます。RPMIでもう一度洗浄手順を繰り返し、余分な媒体をすべて取り除きます。健康なボランティアから慎重にゆっくりと血液を採取し、抗凝固剤を含まない9ミリリットルの中性ポリプロピレンチューブに集めます。

2ミリリットルの細胞被覆ビーズを含むポリプロピレンチューブのそれぞれに8ミリリットルの血液をゆっくりと移し、総体積を10ミリリットルにします。早期のEC活性化を避けるために、血液とビーズを慎重に取り扱ってください。血液ビーズ混合物を慎重に傾けて均等に混合し、キャップをパラフィンフィルムで密封します。

チューブを37°Cのインキュベーター内の穏やかな設定の水平傾斜テーブルに置き、凝固時間を記録します。設定された時間間隔で、血清または血漿分析のために、少なくとも1.5〜2ミリリットルの血液ビーズ混合物を除去します。.血清採取のために、血液を凝固させるために残します。

最後に、チューブを2, 500Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。血清または血漿は、使用するまで摂氏80度で保管してください。.CD31と核について染色されたマイクロキャリアビーズは、明確にコンフルエントを示しています。

目視観察により、マイクロキャリアビーズの表面にECの単層が存在すると凝固時間の延長が観察できると判断されました。ブタ大動脈内皮細胞であるPAEC GalTKO/hCD46/hTBMがマイクロキャリアビーズ上に存在する場合、凝固時間の有意な増加が観察され、補体系と凝固系の両方の調節が成功したことが示唆されました。習得すると、内皮細胞でコーティングされたビーズと非抗凝固剤を施したヒト血液とのインキュベーションは約6時間で完了します。

実験の実際の期間は、主に実験で見られる凝固時間に依存します。この手順を試みる際には、内皮細胞でマイクロビーズを完全に覆い、ヒトの血液の早期活性化を防ぐことを覚えておくことが重要です。