Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Hallo, mein Name ist Christian Deffge. Ich bin Arzt am Universitätsklinikum Magdeburg und arbeite in der kardiovaskulären Forschungsgruppe von Dr. Herold und Professor Braun-Dullaeus. Wir untersuchen die Steigerung des Collateral Growth.

Daher verwenden wir Bildgebung. In diesem Video wollen wir unsere Methoden erklären. Resuspendieren Sie die Zellen in serumfreiem Kulturmedium mit einer Dichte von eins mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter.

Geben Sie fünf Mikroliter eines Millimolaren DIO und Dimethylformamid zu einem Milliliter der Zellsuspension und resuspendieren Sie vorsichtig. Inkubieren Sie die Zelllösung bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Zentrifuugieren Sie die Zellen bei 500 g für fünf Minuten.

Lösen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 37 Grad Celsius warmem FCS-Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer und Lichtmikroskopie.

Resuspendieren Sie die Zellen mit Natriumchloridlösung. Injizieren Sie die Zellen in die Schwanzvene. Die Matrigel-Matrix ist ein rekonstituiertes Basalmembranpräparat, das aus dem Plattenepithelsarkom gewonnen wird.

Es untersucht Testmoleküle entweder auf die Bildung von Endothelzellnetzwerken oder auf Krebstherapien durch angiogene Hemmung. Neubewertung des tumorangiogenen Potenzials von Monozyten, die wir für die Zelltherapie verwenden wollen. Geben Sie 100 Nanogramm BFGF, 300 Nanogramm VEGFA und 26 internationale Einheiten Heparin unter sterilen Bedingungen in das Matrigel.

Nachdem Sie die Lösung vortexiert haben, füllen Sie sie in eine Milliliter-Insulinspritze und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf Eis. Um die subkutane Matrigel-Plaque besser sichtbar zu machen, rasieren Sie die Haut der Maus an der Injektionsstelle. Sie können ein scharfes Skalpell oder eine Enthaarungscreme verwenden.

Legen Sie das Tier auf den Tisch und halten Sie die Haut der Maus neben der Injektionsstelle an der Flanke. Injizieren Sie 500 Mikroliter Matrigel subkutan. Aus praktischen Gründen ist es notwendig, das Matrigel kompakt an einer Stelle zu injizieren, um eine subkutane Dispersion zu vermeiden.

Es wird einfacher sein, die Matrigel-Matrix aus dem Gewebe zu lösen, nachdem die Maus am Ende des Experiments geopfert wurde. Üben Sie die Monozyteninjektion mit Natriumchloridlösung, bevor Sie experimentieren. Wenn die Monozyten nicht systemisch appliziert werden können, tritt keine systemische Wirkung ein.

Im Rahmen dieses Protokolls haben wir 2,5 Millionen Monozyten injiziert. Versuchen Sie, nicht mehr als fünf Mikroliter pro Gramm zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass die Maus während des gesamten Vorgangs mit Hilfe eines Heizkissens erwärmt wird.

Für die systemische Anwendung der Zellen benötigen Sie einen Rückhalteapparat und eine Milliliter Insulinspritze, eine 30-g-Nadel sowie die resuspendierten Monozyten und Natriumchloridlösung. Fassen Sie die Maus vorsichtig an und halten Sie das Tier im Fixierapparat fest. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht verletzt wird und ausreichend Platz zum Atmen hat.

Lege das Zurückhaltemittel so auf das Heizkissen, dass der Schwanz die Platte berühren kann. Stellen Sie sicher, dass Sie die Injektionsstelle desinfizieren, um eine Infektion zu vermeiden. Identifiziere die Schwanzvenen, die sich an der lateralen Seite des Schwanzes befinden.

Drehe den Schwanz um 90 Grad, so dass die Schwanzvene auf der Oberseite des Schwanzes erscheint. Versuchen Sie, die Monozytenlösung in einem flachen Winkel zu injizieren. Beobachten Sie das Tier 30 Minuten lang, um nach systemischen Nebenwirkungen zu suchen.

Setzen Sie die Maus in ihren Käfig, nachdem sich das Tier vollständig erholt hat. Legen Sie die anästhesierte Maus auf den vorgewärmten Mikroskoptisch, nachdem das Mikroskop stabile Bedingungen erreicht hat und die Einstellungen mit einem Dummy getestet wurden. Fixiere die Pfoten mit Klebeband.

Desinfizieren Sie die Haut an der Stelle des Beins oder der Flanke, die für die Mikroskopie verwendet wird. Rasieren Sie die gewünschte Region, um eine bessere Handhabung zu ermöglichen und eine Beeinträchtigung des Haares zu vermeiden. Halten Sie den interessierenden Bereich feucht.

Andernfalls wird die Qualität der Bilder und des Gewebes beeinträchtigt. Lege das Bein zwischen zwei verstellbare Stiele. Positionieren Sie ein Deckglas auf den Stielen.

Starten Sie die Mikroskopie und passen Sie bei Bedarf die Position des Beins an. Die Mikroskopeinstellungen hängen von der verwendeten Software ab. Weitere Informationen finden Sie im Protokoll.

Unsere Daten zeigen, dass die Intravitalmikroskopie ein wirksames Werkzeug zur Visualisierung von transplantierten Monozyten im Blutfluss in Kleintiermodellen darstellt. Die Monozyten müssen in das venöse System injiziert werden, um die systemische Wirkung aufrechtzuerhalten und Embolien zu vermeiden, die auftreten können, wenn die Injektion im arteriellen System durchgeführt wird. Wenn Matrigel verwendet wird, hilft eine langsame Injektion, um eine Dispersion zu vermeiden, bei der Plaque-Explantation für die weitere histologische Untersuchung.

Innerhalb der Matrigel-Plaque sind wir in der Lage, die Vaskularisation durch Zählen von Kapillaren in verschiedenen experimentellen Settings zu messen. Die Befunde der Intravitalmikroskopie können durch histologische Untersuchungen verifiziert werden. Wir sind in der Lage, intravitalmikroskopisch nachgewiesene Monozyten in allen Gewebeschnitten zu finden.

Wenn viel Zeit für die Aufnahme von Bildern benötigt wird, nimmt die Menge an Rhodamin-Dextran im Gefäß ab. Für eine bessere Sichtbarkeit der Gefäße muss die Anwendung des Rhodamin-Dextrans wiederholt werden. Die Verwendung von positiven Sonden für Zellen auf Matrigel kann helfen, optimale Einstellungen zu erhalten.

Das Ziel von Therapeutika für periphere arterielle Verschlusskrankheit oder ischämische Herzkrankheit besteht darin, die Durchblutung anderer durchbluteter Bereiche zu erhöhen, die durch hämodynamische Stenosen verursacht werden. Die Zelltherapie über Monozyten-verstärkte Perfusion durch Stimulation der Kollateralbildung ist eine nicht-invasive Option für Patienten ohne Indikation für eine Operation. Neben der Entwicklung von Kollateralarterien im ischämischen Bereich können Monozyten auch das Wachstum von Tumoren beeinflussen.

Um diese Prozesse zu untersuchen, verwenden wir die Matrigel-Injektion in Verbindung mit der Intravitalmikroskopie. Unser Ziel mit diesem Protokoll ist es, eine einfache und effiziente Möglichkeit zu demonstrieren, immunologische Prozesse, die durch Ischämie verursacht werden, in einem in vivo-Modell zu untersuchen. Mit dieser neuen Methode sind wir in der Lage, eine realistischere Testumgebung im Vergleich zur histologischen Aufarbeitung von postmortalem Muskelgewebe zu generieren.