Name: 제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 배우세요 혈뇌장벽 모델에서 TEER를 직접 측정하는 전극 통합 오가노온칩 제조 방법을. 이 기술은 약물 개발 및 맞춤형 의학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 기꺼이 유익한 토론 및 지원 데이터 표현에 대 한 금형 및 Mathijs 브 롱 호스트의 제조에 Johan Bomer 인정합니다.
이 연구에 의해 투자 되었다: SRO 의치 렌 L.I. Segerink, 미 라 연구소의 생명 공학 및 기술 의학, Twente의 대학; SRO 기관-에-칩 광고 판 데르 Meer, 미 라 연구소의 생명 공학 및 기술 의학, Twente의 대학; 그리고 VESCEL, ERC 고급 부여 A. 반 덴 베 르 그 (보조금 번호 669768).

1. 기관-온-칩 소자의 제조 <ol><li>채널 디자인, 표준 포토 리소 그래피 기술을 사용 하 여 조작 형의 PDMS 복제를 확인 하 고 미세 칩의 PDMS 부분을 얻을.
	<ol><li>무게 약 27 g PDMS 기본 에이전트 및 2.7 g 경화제; 대량 비율 10: 1을 해야 합니다. 이것은 3 m m 두꺼운 PDMS 슬 래 브 형 130 m m (5 인치) 직경에 대 한 좋은입니다. 이러한 구성 요소를 철저 하 게 혼합.</li>
		<li>기포를 제거 하는 약 45 분 동안 desiccator에 섞어 드.</li>
		<li>한편, 금형 주위에 명확한 테이프 여 액체 PDMS 혼합물에 대 한 금형을 준비 하거나 금형에 적합 한 웨이퍼 홀더.</li>
		<li>금형에 degassed PDMS 혼합물을 붓는 다. 만약 거품이 남아 PDMS 혼합물 또는 금형 표면에 공기 드 그것은 다시 약 30 분에 대 한</li>
		<li>오븐 4 헤를 허용에 대 한 60 ° C에서 PDMS 혼합물을 치료.</li>
		<li>교류 후드에서 형에서 치료 PDMS를 당겨, 금형 더 PDMS 복제본을 즉시 다시 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>별도 상단 및 하단 칩 부품은 PDMS에 절단 라인을 사용 하 여 잘라 PDMS 복제.</li>
		<li>양식 인 레트와 출구를 1 m m 직경을 가진 날카로운 생 검 펀치를 사용 하 여 상단 부분에 4 개의 구멍을 펀치. 내부에서 펀치를 칩에 수집에서 PDMS 파편을 방지 하기 위해 외부. 먼지에 대하여 그들을 보호 하기 위해 명확한 테이프와 칩 부분을 커버.</li>
		<li>Transwell 삽입에서 폴 리카 보 네이트 막 약 3 × 3 m m의 사각형으로 잘라 2.</li>
	</ol></li> <li>다공성 막 2 층 장치를 조립 하기 위해서는 두 PDMS 부분 사이 누설 없는 인터페이스는 다공성 막으로 어셈블. 
	참고:이 프로토콜은 Griep 외에서 적응. 19 그리고 Chueh 외. 26 <ol><li>준비 PDMS/톨루엔 박격포 PDMS 기본 에이전트, 경화제의 0.07 g과 톨루엔의 540 µ L의 0.7 g을 사용 하 여 결과 5:3 무게 비율에. 소용돌이 박격포 철저 하 게.</li>
		<li>60 1500 rpm에서 유리 coverslip에 박격포의 스핀 코트 200 µ L s (1000 rpm/s에서 ramped) 박격포의 얇은, 유니폼 레이어를 얻으려고.</li>
		<li>하단 부분 그리고 잉크 롤러 칩의 상단 부분에 coverslip에서 박격포의 얇은 층을 전송합니다. 맨 아래 부분 오븐 안전 접시에 넣어.</li>
		<li>핀셋, 집합으로 스핀 코팅 박격포에 막의 가장자리와 하단 부분에 중간에 신중 하 게 배치</li>
		<li>신중 하 게 배치 상단 부분 아래쪽에 정렬에 신경을 쓰는 동안. 
		참고: 칩에 압력을가 하지 마십시오 그리고 박격포는 채널을 입력 하 고 막 막힘을 방지 하기 위해 아래 부분 상단 부분을 슬라이드 할.</li>
		<li>명확한 테이프 칩 입력에서 먼지를 방지 하 고 60 ° C 3 h.에서 그들을 구워와 칩 후미를 커버</li>
	</ol></li> <li>전극 측 채널로 통합. 
	참고:이 프로토콜은 Griep 외에서 적응. 19와 Douville 외. 18 <ol><li>30 분 린스 물과 에탄올에 아세톤에 그들을 잠수 하 여 조각의 약 2 cm. 클린으로 백 금 철사를 잘라 건조 허용.</li>
		<li>교류 후드, 플라스틱 접시에 칩을 넣어. 핀셋의 쌍을 사용 하 여 칩의 전극 채널에 4 개의 백 금 철사를 삽입 하 고 단계에서 접시에 고정 수 있도록 플라스틱 접시에 그들을 구 부. T-모양의 채널 접합 과거 문화 채널에 m m 0.7-1 전선 삽입.</li>
		<li>전극 채널 입구에서 UV 경화 접착제의 방울을 적용 하 고 모 세관 힘에 의해 전극 주위 채널을 채우기 위해 접착제 허용.</li>
		<li>전극 채널의 끝에 도달 하면 자외선 치료 접착제에 전환. 
		주의: 보이지 않는 UV 광원으로로이 당신의 눈을 손상 할 수 있다.</li>
		<li>흥분 2 분 에폭시 접착제와 플라스틱 접시를 4 개의 통합 된 전극. 이로써 전극의 전극 칩에서 당기의 위험 없이 측정 하는 동안 쉽게 처리.</li>
		<li>명확한 테이프와 칩을 커버 하 고 2 h. 진정 하 고 먼지 무료 사용까지 저장 허용에 대 한 60 ° C에서 구워. 이 방법으로 그들은 수는 달에 대 한 안전 하 게 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. 온 칩 두뇌 파생 된 내 피 세포의 문화 <ol><li>코트 셀 첨부 파일 홍보 칩.
	와 성 <ol><li>채우기 두 채널 버퍼링 식 염 수 (PBS) 시 약을 도입 하기 전에 젖은. 확인 현미경 경우 채널에 모든 공기 거품. 그렇다면, 여분의 PBS를 가진 홍 조 하 여 그들을 제거.</li>
		<li>두 채널의 PBS에서 20 µ g/mL 인간의 fibronectin 30 µ L 입력합니다. 3 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 공기 방울에 대 한 확인 하 고, 필요한 경우 플러시 PBS 가진 채널 및 fibronectin 솔루션 리필.</li>
		<li>내 피 성장 매체와 칩을 제거 하 고 37 ° C와 5% CO 2 2 헤 대 한 인큐베이터에 그들을 품 어</li>
		<li>채널에 유체와 직접 접촉에 있는 전극의 모든 보장 하기 위해 3 단계에 설명 된 대로 빈 칩의 TEER를 측정 합니다. 빈 칩, 일반적인 TEER 값은 0-1 Ω cm 2.</li>
	</ol></li> <li>셀 맨 위 채널에 씨앗.
	<ol><li>인간의 대뇌 microvascular 내 피 세포 (hCMEC/D3)의 confluent 단층으로 문화 플라스 크 (75 cm 2 문화 영역)에서 문화 매체를 제거.</li>
		<li>는 PBS로 세포 세척. 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 하 고 셀 문화 플라스 크에서 분리가 될 때까지 2-5 분 동안 37 ° C, 5% CO 2에서 품 어.</li>
		<li>20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 하는 문화 매체는 트립 신을 비활성화 합니다. 계산 셀과 셀 서 스 펜 션의 총 수를 계산.</li>
		<li>한편, 원심 390 x g 5 분에서 hCMEC/D3 셀 하 고 상쾌한 제거.</li>
		<li>적절 한 양의 내 피 성장 매체 (EGM-2) 5 x 10 6 셀/mL의 농도에 도착에 셀 펠 릿을 resuspend. 이 칩에 2 x 10 5 셀/c m 2의 시드 밀도 결과.</li>
		<li>천천히 맨 위 채널에 잘 혼합된 세포 현 탁 액의 30 µ L 플라스틱 하 고 여전히 압력을 발휘 하면서 유창 모션에 입구에서 피펫으로 제거.</li>
		<li>현미경 시드 밀도 확인합니다. 맨 위 채널에 걸쳐 세포의 균일 한 분포를 달성 해야 합니다.</li>
		<li>적어도 1 h. 위해 37 ° C, 5% CO 2 칩 내 피 문화 매체와 연결 되지 않은 셀 밖으로 플러시 품.</li>
	</ol></li> <li>칩에 내 피 문화를 유지.
	<ol><li>두 번, 하루는 후미에서 저수지로 문화 매체 가득 피 펫 팁을 삽입 하 고 중력 기반 흐름에 의해 칩 내부 매체를 대체. 
		참고:는 microchannels 입력 하 고 셀 계층 파괴에서 공기 방울을 피하기 위해, 입력부에 끝을 삽입 하기 전에 피 펫 팁과 칩 위에 액체 액체-액체 접촉 하 게 있는지 확인 합니다. 이에 작은 방울을 추가 하 여 촉진 될 수 있다는에 / 피 펫 삽입 전에 콘센트.</li>
		<li>채널 건조 하지 않도록 매장에서 피 펫 팁 저수지를 추가할 수도.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO 2 칩을 품 어.</li>
	</ol></li></ol> 3. 온 칩 TEER 측정 <ol><li>일 설정e TEER 측정 장치, 잠금 증폭기 및 프로브 케이블 회로 반 데르 조 타 외에 지정 된 구성. 16 또는 potentiostats 또는 임피던스 분석기는 또한 이러한 임피던스 기반 TEER 측정에 적합.</li>
	<li>인큐베이터에서 칩을가지고 고 어떤 액체 전극 칩의 외부 연결을 방지 하기 위해 전극 주위 플라스틱 접시에서 적어도 10 분 제거에 대 한 실내 온도 도달 하도록.</li>
	<li>200 Hz에서 임피던스 스펙트럼 예상된 크기와 모양의 TEER 측정으로 유효성을 검사 하는 경우만 5-10 분 확인에에서 칩 당 6 임피던스 스펙트럼의 결과로 2 개의 전극의 각 조합에 대 한 1 MHz 임피던스 스펙트럼을 걸릴 결과 섹션에 설명 된.</li>
	<li>측정을 완료 한 후 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 다시 칩을 넣어.</li>
	<li>정규화 TEER 값을 얻은 임피던스 스펙트럼 처리 합니다.
	<ol><li>Get은 측정된 저항 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg"> 전극 사이 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg">와 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg">, 그림 2B에서 D, 해당 임피던스 스펙트럼에 10 kHz에서 저항 원에서 표시.</li>
		<li>계산 사용 하 여 한 번에 하나의 칩에 해당 하는 6 측정된 저항 TEER 그림 2G 16의 방정식을 사용 하 여 포인트: 
		<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg"> 이 방정식에서 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg">는 저항 측정, 문화 영역 &lt; img alt = " 방정식 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ &gt;은 세포 벽과 멤브레인, 저항 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg">, <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg">, <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg"> 및 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg">는 저항 세포 장벽을 통해 값 측정 및 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg"> 및 <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg"> 저항 값 측정 되는 스트레이트 채널입니다. 16 방정식에서에서 파생 된 등가 회로 그림 2C에.</li>
	</ol></li> <li>는 TEER의 개발 시간에서을 얻기 위해 모든 시간 포인트에서 TEER에서 빈 TEER 빼기.</li></ol>

<ol><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-Chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-chip+technology+for+blood-brain+barrier+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+barriers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research.</a> Tissue barriers. 4 (1), e1142493(2016).</li>
<li>Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-1-4614-9105-7">Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series</a>. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).</li>
<li>Odijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+direct+current+trans-epithelial+electrical+resistance+in+organ-on-a-chip+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems.</a> Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+Measurement+Techniques+for+In+Vitro+Barrier+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Brown, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recreating+blood-brain+barrier+physiology+and+structure+on+chip%3A+A+novel+neurovascular+microfluidic+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).</li>
<li>Deosarkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Dynamic+Neonatal+Blood-Brain+Barrier+on+a+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0142725(2015).</li>
<li>Ferrell, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+bioreactor+with+integrated+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+electrodes+for+evaluation+of+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+bioeng%22%5BJournal%5D)">A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells.</a> Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).</li>
<li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li>
<li>Partyka, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+regulates+transport+in+a+compliant+3D+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier.</a> Biomaterials. 115, 30-39 (2017).</li>
<li>Van der Helm, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+quantification+of+transendothelial+electrical+resistance+in+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectr%22%5BJournal%5D)">Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips.</a> Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22422217">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB).</a> Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).</li>
<li>Douville, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+two-layered+channel+system+with+embedded+electrodes+to+measure+resistance+across+epithelial+and+endothelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chemi%22%5BJournal%5D)">Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers.</a> Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+ON+CHIP%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnol Bioeng. , (2016).</li>
<li>Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Endothelial+Cells%2C+Pericytes%2C+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood%E2%80%93Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier.</a> Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).</li>
<li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400515301672">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969996109002083">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+the+blood-brain+barrier%3A+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).</li>
<li>Weksler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Chueh, B. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leakage-free+bonding+of+porous+membranes+into+layered+microfluidic+array+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chem%22%5BJournal%5D)">Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems.</a> Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).</li>
<li>Golowasch, J., Nadim, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGolowasch%2C+J+%22Encyclopedia+of+Computational+Neuroscience%22">Encyclopedia of Computational Neuroscience</a>. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).</li>
<li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+cell+monitoring%3A+barrier+properties+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 원고는 기관-온-칩 소자의 엔지니어링 및 장치에 배양 세포 방 벽의 transendothelial 전기 저항 (TEER)의 직접적인 결정 발표 됐다. 크린 룸 장비 및 4 개의 전극을 사용 하 여 직접 TEER 결정 없이 전극 통합의 제시 방법 두 미세 구획 어떤 기관-온-칩 장치에 적용 됩니다. 2 개의 구획에 4 개의 전극 분리로 칩 레이아웃 및 형상이 상상된 실험의 요구 사항에 맞게 적용할 수 있습니다. 4 전극 수도 편리 하 게 삽입 기존 칩의 후미에는 그들은 6 측정 기간에 대 한 장소에 집착 하 고 있다. 누설 없는 접합 방법은 PDMS/톨루엔 비율을 변경 하 여 다른 세포 막 및 채널 형상에 대 한 최적화할 수 있습니다. 더 높은 톨루엔 콘텐츠 박격포26 의 얇은 스핀 코팅 층에 결과 및 더 얕은 및 좁은 채널 PDMS 부품에 적합 있을 수 있습니다. 더 두꺼운 박격포의 낮은 톨루엔 콘텐츠 결과26 레이어 고 PDMS 부품 사이의 두꺼운 막을 묶는 데 더 적합할 수 있습니다.
그림 2A 에서 도식 임피던스 스펙트럼 및 그림 2E 와 2F에실험 스펙트럼에서 볼 수 있듯이 임피던스 측정 전극 매체 인터페이스에서 더블 레이어 커패시턴스에 의해 영향을 받습니다. microchannels 내부 전극의 작은 크기로 인해 더블 레이어 커패시턴스는 TEER의 정량화를 복잡 하 게 임피던스 스펙트럼에 세포 벽의 저항 고원 위에 지배할 수 있습니다. 이 극복 하기 위해 전극 삽입 될 수 있다 고정 하기 전에 문화 채널에 추가. 이것은 노출 하는 전극의 표면적을 증가 더블 레이어 커패시턴스 뿐만 증가 문화 매체와 그. 이 결과 용량 성 기울기의 변화에 더 낮은 주파수, 세포 벽의 저항 고원 보다 쉽게 인식 하 고 정량 될 수 있도록 었 어 요. 두 개의 전극 사이 측정된 경로의 저항 작은 될 것입니다, 하지만이 하지 제시 방법을 TEER 정량화를 좌우할 것 이다.
세포 장벽을 통해 측정 하는 동안 추가 저항 고원 인식 될 수 없다 가능 하다. 이 예 막 제대로 묶인는 박격포에 의해 세포 장벽 주위에 측정 된 경로에 지도 하는 경우 두 채널 사이의 유체 연결의 결과일 수 있습니다. 또한, 거기 수 전극 문화 매체의 물방울에 의해 연결 되어 있는 경우 칩 외부 전기 브리징. 이것은 일반적으로 낮은 측정 된 임피던스와 결합 하 고 문화 매체의이 다리를 제거 하 여 해결할 수 있습니다. 마지막으로, 거기는 아무 저항 측정 된 임피던스의 크기 순서는 예상 보다 높은 경우 또는 전원에 전기 배선에서 느슨한 연결 수 있습니다.
미래에 현재 BBB-온-칩의 생리 적인 관련성 전단 BBB 차별화 및 증가 장벽 압박감을 증진에 보고 하 고 달성 하기 어렵다 생리 적 수준에서 스트레스를 내 피 세포를 노출 하 여 증가 될 수 있다 기존의 생체 외에서 모델. 29 또한, 제시 장치의 하단 채널 endothelium와 공동 경작 수를 두뇌 파생 셀에 대 한 적합 한 구획을 제공 합니다. 이것 또한 장벽 기능을 증가할 것으로 예상 하 고 또한 병 적인 조건 하에서 관련 세포 유형 사이 복잡 한 상호 작용의 연구를 수 있습니다. 29
결론적으로,이 책에서 설명한 장기-온-칩 장치 표준 실험실 장비를 사용 하 여 날조 될 수 있다 고 공부 셀의 시각적 검사를 방해 하지 않는 4 개의 통합 된 전극을 사용 하 여 직접 TEER 측정을 제공 하는 표시 됩니다. 레이어입니다. 이 장치 기관에 칩 분야에서의 적용이이 칩에 BBB를 흉내 낸는 TEER 문화 기간 동안 모니터링을 시연 했다. 다른 (장벽) 장기의 호스트는이 칩에 다른 관련 셀 종류를 포함 하 여 유사 수 있습니다. 또한, TEER 측정 하는 방법은 다른 두 구획 기반 기관-온-칩 장치를 장치 및 시스템에 비해 사용할 수 있는 재현 하 고 의미 있는 TEER 값에 도착에 쉽게 적용할 수 있습니다.

장기에 칩 빠르게 새로운 급부상 하 고 유망한 생체 외에서 의 클래스 조직 모델. 1 이러한 모델에서 셀 교양 그들은 그 세포의 생리 적인 microenvironment을 모방 하는 방식으로 설계 하는 미세 장치 내부. 1 , 2 결과 그 셀의 현실적 생리 적 또는 병 적인 동작 보다 기존의 생체 외에서 모델의 단순한 설계 및 기본적인 기능에서 예상 될 수 있다. 3 , 5 , 6 또한, 장기에 칩 비보에 모델 보다 더 나은 제어 환경을 제공 하 고 인간의 생리와 병 리를 충실 하 게 복제 인간의 기원에서 모두 건강 하 고 병에 걸린 조직을 통합할 수 있습니다. 칩 (BBBs에 칩)에 혈액-뇌 장벽을 개발에 최근 요약된 발전 분야는 신속 하 게 이동 앞으로 보여줍니다. 7
장기에 칩의 또 다른 장점은 조직 현미경 검사 법, 온라인 생 화 확 적인 분석 그리고 통합된 센서 장치 내부에 교양의 실시간 연속 모니터링 수 있다는. 1 , 2 예, 비 접촉 개발 모니터링을 위한 강력한 방법 이다 transendothelial 또는 transepithelial 전기 저항 (TEER) 측정 및 장벽 형성의 조직. 8 , 9 , 10 TEER 전기 저항 세포 장벽을 가로질러 이며 따라서 장벽 무결성 및 침투성을 나타내는 있습니다. 10 장기에 칩, 세포 장벽 일반적으로 교양 두 대표는 꼭대기 유체 채널 및 그 장벽 조직의 basolateral 구획을 구분 하는 막에. 이러한 칩 TEER 측정 후미와 2 채널의 콘센트에 삽입 된 전극으로 편리 하 게 수행할 수 있습니다. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 그러나 15 , 수동 삽입 및 전극의 재 투입 될 수 있습니다 쉽게 배치 오류에 따라서 예를 들면 으로 측정 된 저항 변화에 microchannels 통해 긴 또는 짧은 경로 저항 차이 중요 한에 비해 셀 장벽 저항. 16 reinsertion 오류를 제거 하려면 통합된 전극 장치 제안 되었습니다. 그러나,이 통합 된 전극의 대부분 조직 문화17,,1819,20,21 을 검사 하는 경우는 보기 차단 및 필요 전문 클린 룸 제작에 대 한 처리합니다. 17 , 22
이전 간행물,16 에 처음 적용 하는이 책에서 설명한 장기-온-칩 장치 측정된 셀 레이어 및 쉬운 제작에 시정 통합된 전극의 안정성을 결합 합니다. 설계 및이 칩의 제조는 그림 1에 묘사 된다. 즉,이 장치 부품 이루어져 있다 2입니다 (PDMS) 함께 결합 채널 인쇄물과 0.4와 폴 리 카보 네이트 막으로 누설 무료 µ m 모 공 사이. 4 개의 백 금 철사 전극 삽입 되 고는 photocurable와 함께 제자리에 고정 문화 영역 외부에 잘 접착. 모든 제작 단계 일반 실험실 장비, 클린 룸 환경에 대 한 필요 없이 수행할 수 있습니다. 또한, 6 임피던스 측정을 수행할 수 있습니다 microchannels 횡단면을 고의 영향을 최소화의 저항의 독립적인 측정된 TEER의 직접 격리 하므로 이러한 4 개의 전극를 사용 하 여 (재) 삽입 오류와 같은 시스템에서 비 생물 유사. 16
이 장치와 직접 TEER 측정의 적용을 보여, 혈액-뇌 장벽 (BBB)이이 칩에서 복제 되었다. 이 생물 학적 장벽이 전문된 내 피 세포의 구성 되어 있으며 혈액과 뇌 항상성 제공 하는 뇌 간의 전송 규제. 23 , 24 BBB 모방, 미세 소자의 맨 위 채널은 줄지어 (친절 하 게 제공 박사 P. o. hCMEC/D3 셀 라인에서 인간의 대뇌 microvascular 내 피 세포 Couraud, INSERM, 파리, 프랑스). 그러나 25 제시 방법은,, 더 일반적으로 두 개의 구획 어떤 기관-온-칩을 적용, 직접 TEER 결정을 쉽게 사용 하 여 활성화 통합 전극.
이 원고에서 먼저 통합된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 제조 과정은 설명 되어 있습니다. 온 칩 TEER 측정 뿐만 아니라 다음, 시드 절차와 장치 내부에 뇌 내 피 세포의 문화 설명 된다. 결과 섹션에서 대표 TEER 측정 표시 하 고 데이터 처리를 명확히. 마지막으로,는 BBB-온-칩, 3 일 동안 모니터링의 장벽 기능 제공 됩니다, 표시 장치 및 TEER 모니터링 하는 방법의 적용을 보여주는.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) 기본 대리인 및 경화제: Sylgard 184 실리콘 탄성 중합체 장비</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic 테이프</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치, 1.0 mm 직경</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 막, 0.4 &micro; m 숨구멍 크기</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>Transwell 문화 삽입</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Platinum wire, 200 &micro에서 절단; m 직경</td><td>Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr><tr><td>UV 경화 접착제: Norland Optical Adhesive 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 접착제: Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3 세포</td><td></td><td></td><td>인간 대뇌 미세혈관 내피 세포주, P.-O 박사가 친절하게 제공합니다. Couraud, INSERM, 파리, 프랑스</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈장 피브로넥틴, 20 &마이크로; g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>내피 성장 배지-2(EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>내피 기저 배지-2(EBM-2) EGM-2 SingleQuots</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터: Spin 150</td><td>Polos</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>UV 광원, 350 mW/cm에서 5초 동안 365 nm2</td><td>사내</td><td></td> <td>제조</td></tr><tr><td>원심분리기: Allegra X-12R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>바인더</td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Boxense</td><td>LocSense</td><td></td><td>온칩 TEER 측정에 특화된 프로브 케이블 회로가 있는 락인앰플리</td></tr></tbody></table>파이어

제조 및 통합된 전극 transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

장기에 칩, 생체 외에서 모델 미세 장치 내부 (인간의) 조직 문화를 포함는 급속 하 게 신흥 및 유용한 제공 하기 위해 약속 연구 공부 하는 인간의 건강 및 질병에 대 한 도구. 기관-온-칩 장치 안으로 경작 하는 세포 층의 장벽 기능 특성, 종종 transendothelial 또는 transepithelial 전기 저항 (TEER) 측정 됩니다. 이 위해, 전극 보통 칩의 후미에 전극의 수동 삽입 달성 보다 더 안정적인 측정을 제공 하 여 미세 칩에 통합 됩니다. 그러나, 이러한 전극 자주 공부 셀 층의 육안 검사를 방해 하거나 비싼 클린 프로세스 제작에 대 한 필요. 이러한 한계를 극복 하기 위해 여기에 설명 된 장치 배치 하 고 시각적 검사를 가능 하 게 하는 문화 영역 외부 고정 4 쉽게 통합된 전극을 포함 되어 있습니다. TEER 고립 될 수 있다 직접, 문화 매체 가득 microchannels 저항의 독립적인 6 측정 경로 저항 양이 정해질 수 있다,이 4 개의 전극에 사용 하 여. 혈액-뇌 장벽 했다이 장치에 복제 하 고 그 TEER 표시 장치 적용을 모니터링 했습니다. 이 칩, 통합된 전극 및 TEER 결정 방법 장기에 칩, 다른 장기를 모방 하거나 기존의 기관-온-칩 시스템에 통합 될 수 있는 일반적으로 적용 됩니다.

셀 (실선) 없이 칩을 통해와 세포 장벽 (파선)을 통해 전기 임피던스 분광학의 도식 결과 그림 2A에 표시 됩니다. 4 개의 주요 영역을 확인할 수 있습니다, 그리고 각각 특정 전기 구성 요소에 의해 지배. 약 1khz 아래 전극 문화 매체 인터페이스에서 더블 레이어 커패시턴스 지배, 임피던스 크기와 접근 하는-90 ° 위상 변화에 대 한 부정적인 사면이 특징. 주파수는 더블 레이어 커패시턴스 지배, 문화 매체에 노출 전극 영역에 따라 달라 집니다. 미세 채널의 채널 길이 및 단면적, 내부에 따라 내부 문화 매체의 저항에 해당 하는 0 °에 가까운 위상 변화를 1khz (셀) 없이 또는 100 kHz (셀)와 위에 저항 고원은 막, 다공성 및 두께 따라 세포 장벽을 통해 측정, 1, 10 kHz 사이 여분 저항 고원 단계 다이어그램에서 현지 최대 뿐만 아니라 볼 수 있다. 이 때 임피던스 결과에 명확한 증가 TEER의 결정에 대 한 중요 한 중요성의 셀 측정된 경로에 존재 하 고 따라서 "관심 영역" 이라고 불린다. 10, 100 kHz 사이 추가 슬로프 셀 장벽 커패시턴스는 전기적으로 절연 지질 bilayer 막에서 발생 하 고 셀 층의 총 면적에 따라 달라 집니다에 해당 합니다. 27 임피던스 크기 뿐 아니라 이러한 지역 경계 공부 되 고 시스템에 의존 하 고, 채널 차원, 문화 매체 전도성, 전극 위치 및 셀 형식, 변경. 장벽 형성에 전기 임피던스 분광학의 연습과 이론에 대 한 추가 읽기를 위해 조직 벤슨 외. 여 검토 문서 것이 좋습니다. 28
TEER 측정의 대표적인 데이터 빈 칩과 칩 그림 2E 와 2F, hCMEC/D3 뇌 내 피 세포 층으로 각각 표시 됩니다. 즉, 임피던스 분광학 4 개의 전극을 가진 6 측정을 사용 하 여 수행 되었다: 세포 배양 매체 가득 채널 (실선)을 통해 두 측정 및 4 개의 측정 채널 막 통해 및--존재 하는 경우는 세포 장벽 (파선) 했다입니다. 6 측정 경로 그림 2B, 도식 단면도 (그림 2C) 및 평면도 (그림 2D)에서 파생 되는 등가 저항 회로에서 확인할 수 있습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 빈 칩 측정 (그림 2E) 셀 없이 임피던스 스펙트럼의 전형적인 형태를 보여. 세포 벽 ( 그림 2F에 파선)을 통해 측정 닮은 그림 2A에 셀 일반적인 임피던스 스펙트럼. 참고 임피던스 크기와 위상 이동 증가 1 MHz로. 높은 주파수에서 측정 설정의 전형적인 응답 이며 실험적인 근원의 아니다.
확인 하려면 TEER 이러한 실험 임피던스 스펙트럼을 사용 하 여, 먼저 측정된 칩 저항 결정 됩니다, 셀 레이어, 채널 및 막의 총 저항입니다. 이 위해, 관심 영역에 적합 한 판독 주파수 선정 되었다, 세포와 세포 없이 0 ° 위상 변화에 가까운 단계 음모에 현지 최대에: 10 kHz. 10 kHz에서 6 측정된 저항, 함께 4 개의 전극 사이 측정으로 TEER 직접 계산 됩니다 그림 2 층에 방정식을 사용 하 여.
제시 장치 기관에 칩 TEER 결정 적합 표시, BBB는 칩 내부 복제 했다 하 고 그 TEER 문화의 3 일 동안 모니터링 했습니다. 그림 3A 평균 TEER ± 표준 오차 (SEM) 의미의 칩에 대 한 4 개의 BBBs-에-, 표시는 22 ± 1.3 Ω c m2의 대 지에 결과에 있는 문학에서 보고 된이 세포 선의 TEER 비교입니다. 29 또한, 실험 종료 후 형광 핵의 얼룩, 그것은 볼 수 있습니다 두뇌 endothelium 장치 (그림 3B) 내부 연속 단층을 형성. 면역 형광 염색 꽉 접합 단백질 Zonula Occludens-1 (조로-1)의 뇌 내 피 세포의 BBB-특정 표현 형을 유지 하 고 꽉 접합 복합물을 형성 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg"> 
그림 1: 디자인 및 통합 된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 조립. 
최고 채널 (TC), 막 (M)와 아래쪽 하단 채널 (BC) PDMS 부분 PDMS 윗부분의 구성 된 미세 칩의 (A) 분해 보기. 4 개의 백 금 철사 전극 (E1 ~ 4) 삽입 하 고 옆 채널에 고정 됩니다. 맨 위 채널에 막 위에, hCMEC/D3 뇌 내 피 세포 BBB 복제를 경작 했다. (B) 플라스틱 접시에 고정 칩 조립. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg"> 
그림 2: 대표 임피던스 데이터 및 TEER의 결정. 
(A) 회로도 임피던스 스펙트럼 표시 임피던스 크기 (Ω) 및 주파수 (Hz), 셀 (파선) 없이 셀 (실선)와 칩에 전기 임피던스 분광학에 대 한 일반적인 대 위상 변화 (°) 4 개 주요 지역, 각각에 의해 지배: 전극, 문화 매체 저항, 셀 장벽 저항 및 셀 막 커패시턴스에 더블 레이어 커패시턴스. "관심 영역" 셀 계층의 기여 정량된 (빨간색 화살표)을 수 있습니다 나타냅니다. (B) 상위 채널 저항 R1 과 R3, 하단 채널 저항 R2 와 R4 와 막 및 EC 장벽 저항 Rm칩의 등가 저항 회로. (C) 도식 크로스 섹션 맨 위 채널에 경작 된 내 피 세포 (EC)를 보여주는. (D) BBB의 도식 평면도 칩 전극의 구성과 0.25 m m2 는 임피던스 측정의 문화 영역을 보여주는. (E) 빈 칩의 대표적인 임피던스 스펙트럼 세포 배양으로 가득합니다. (F) 대표 임피던스 스펙트럼을 hCMEC/d 3에서 칩의 뇌 내 피 세포 3 일에 대 한 문화를 했다. (G) 4 전극의 모든 6 개의 조합 사이 측정 된 저항에서 TEER 계산 공식. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">제발 더 큰 적이 있는 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>이 그림의 한 이온
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg"> 
그림 3: 대표 TEER BBB-온-칩 개발. 
4 BBBs-에-칩의 3 일의 문화 기간 동안 22 ± 1.3 Ω cm2 (평균 ± SEM) 고원 도달 의미 (SEM)의 (A) 평균 TEER ± 표준 오차 비교를 위해, 빈 칩의 데이터 포함, 세포 변형 및 칩의 TEER 값에 비해 같은 기간에 한계 편차와 편차 0 Ω c m2 에서 표시 됩니다. (B) 형광 현미경 검사 법의 스테인드 핵 endothelium, PDMS와는 삽입에 표시 된 위치에 막에의 지속적인 단층을 밝혔다. (C) 면역 형광 꽉 접합 단백질 Zonula Occludens-1, BBB-특정 꽉 접속점 세포 사이 측정된 TEER을 야기할 나타내는의 존재를 공개 했다. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 간행물 transendothelial 전기 저항 (TEER)의 직접 정량화에 대 한 통합 된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 제작을 설명합니다. 유효성 검사, 혈액-뇌 장벽 안쪽이 미세 장치 유사 했다 및 장벽 기능 모니터링 했습니다. 전극 통합 및 직접 TEER 정량화에 대 한 제시 방법 일반적으로 적용 됩니다.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

이 비디오의 전반적인 목표는 경내피 또는 경상피 전기 저항 측정 또는 TEER 측정을 위해 전극이 통합된 마이크로 유체 칩을 제작하고 사용하는 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 마이크로 유체 칩의 혈액 뇌 장벽을 사용하여 입증됩니다. 이 방법은 예를 들어 통합 전극을 사용하여 혈액-뇌 장벽 조직의 장벽 기능을 직접 측정할 수 있도록 함으로써 Organs-on-Chips 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.우리 기술의 주요 장점은 전극이 장기 칩 시스템에 쉽게 통합되고 그 결과를 서로 다른 시스템 간에 비교할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 건강 및 질병, 신약 개발 및 개인 맞춤형 의학에서 혈액 뇌 장벽 기능을 이해하는 데로 확장됩니다. 이 방법은 혈액-뇌 장벽 기능에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 Lung-on-Chip 및 Gut-on-Chip과 같은 다른 장기 칩 시스템의 맥락에서도 사용할 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 PDMS 기제 27g과 경화제 2.7g을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 약 45분 동안 건조제에서 혼합물의 가스를 제거하여 기포를 제거합니다. 한편, 금형 주위에 투명 테이프를 붙여 액체 PDMS 혼합물을 위한 금형을 준비하거나 금형을 적절한 웨이퍼 홀더에 넣습니다.가스가 제거된 PDMS 혼합물을 금형에 붓습니다. 다음으로, PDMS 혼합물을 섭씨 60도의 오븐에서 4시간 동안 경화시키고 나중에 식힙니다. 교차 흐름 후드에서 경화된 PDMS를 금형에서 당겨 빼냅니다.PDMS의 절단선을 사용하여 PDMS 복제본을 별도의 상단 및 하단 칩 부품으로 절단합니다. 그런 다음 직경 1mm의 날카로운 생검 펀치를 사용하여 상단 부분에 4개의 구멍을 뚫어 입구와 출구를 만듭니다. PDMS 파편이 칩에 모이는 것을 방지하기 위해 내부에서 외부로 펀치를 날립니다.그런 다음 칩 부품을 투명 테이프로 덮어 먼지로부터 보호하십시오. 그런 다음 트랜스웰 인서트의 폴리카보네이트 멤브레인을 약 3 x 3제곱밀리미터의 정사각형으로 자릅니다. 그런 다음 다공성 멤브레인과 인터페이스된 2층 장치를 조립하기 위해 두 PDMS 부품 사이에 누출이 없는 다공성 멤브레인을 조립합니다.이를 위해 PDMS 염기제 0.7g, 경화제 07g 및 톨루엔 540마이크로리터를 사용하여 PDMS 톨루엔 모르타르를 준비합니다. 모르타르를 철저히 소용돌이친 다음 200마이크로리터의 모르타르를 1500rpm의 유리 커버슬립에 60초 동안 스핀코트하여 얇고 균일한 모르타르 층을 얻습니다. 그런 다음 잉크 롤러를 사용하여 커버 슬립의 모르타르 얇은 층을 칩의 바닥 부분으로 옮깁니다.바닥 부분을 오븐용 접시에 넣은 다음 모르타르를 칩의 상단 부분으로 옮깁니다. 핀셋 세트를 사용하여 멤브레인의 가장자리를 스핀코팅 모르타르에 담그고 바닥 부분의 중앙에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 정렬에 주의하면서 상단 부분을 하단 부분에 조심스럽게 놓습니다.칩에 먼지가 들어가지 않도록 투명 테이프로 칩 입구를 덮고 섭씨 60도에서 3시간 동안 굽습니다. 이 단계에서는 주의하는 것이 매우 중요합니다. 모르타르가 채널에 들어가 멤브레인을 막는 것을 방지하기 위해 칩에 압력을 가하지 말고 상단 부분을 하단 부분 위로 밀어 넣지 마십시오.전극을 측면 채널에 통합하려면 백금 와이어를 2cm 길이의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 아세톤에 30분 동안 담가둡니다. 그런 다음 물과 에탄올로 헹구고 말리십시오.직교류 후드에서 플라스틱 접시에 칩을 놓습니다. 핀셋을 사용하여 4개의 백금 와이어를 칩의 전극 채널에 삽입하고 플라스틱 접시에 구부려 다음 단계에서 접시에 고정할 수 있습니다. 0.7-1mm의 와이어를 T자형 채널 접합부를 지나 배양 채널에 삽입합니다.그런 다음 전극 채널 입구에 UV 경화 접착제 한 방울을 바르고 접착제가 모세관 힘에 의해 채널을 채우도록 합니다. 그런 다음 UV를 켜고 전극 채널의 끝에 도달하면 접착제를 경화시킵니다. 4개의 통합 전극을 2액형 에폭시 접착제로 플라스틱 접시에 고정했습니다.그런 다음 칩을 투명 테이프로 덮고 섭씨 60도에서 2시간 동안 굽습니다. 식히고 사용할 때까지 먼지가 없는 상태로 보관하십시오. 세포 부착을 촉진하기 위해 칩을 코팅하려면 시약을 도입하기 전에 먼저 두 채널을 PBS로 채웁니다.채널에 기포가 있는지 현미경으로 확인하십시오. 그렇다면 여분의 PBS로 세척하여 제거하십시오. 다음으로, PBS에서 밀리리터당 20마이크로그램의 인간 피브로넥틴 30마이크로리터로 두 채널을 채웁니다.섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 칩을 내피 성장 배지로 씻어내고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 빈 칩의 TEER을 측정하여 모든 전극이 채널의 유체와 직접 접촉하는지 확인합니다.이렇게 하려면 인큐베이터에서 칩을 꺼내 최소 10분 동안 실온에 도달하도록 합니다. 칩 외부의 전기 브리징을 방지하기 위해 전극 주변의 플라스틱 접시에서 액체를 제거하십시오. 다음으로, 두 전극의 각 조합에 대해 200Hz에서 1메가헤르츠까지의 임피던스 스펙트럼을 취하여 5-10분 내에 칩당 6개의 임피던스 스펙트럼을 생성하며, 이를 통해 TEER을 직접 결정할 수 있습니다.임피던스 스펙트럼이 TEER 측정을 검증하기 위해 예상되는 크기와 모양을 가지고 있는지 확인합니다. 이제 hcMEC/D3 세포의 단층이 융합된 배양 플라스크에서 배양 배지를 제거하여 상단 채널에 안착할 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 씻으십시오.PBS를 제거한 다음 2밀리리터의 05% 트립신 EDTA를 첨가하고 세포가 배양 플라스크에서 분리될 때까지 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다. 그런 다음 20% FBS가 보충된 배양 배지로 트립신을 비활성화합니다. 세포를 세고 현탁액의 총 수를 계산합니다.한편, hcMEC/D3 세포를 390배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 적절한 부피의 내피 성장 배지에 다시 현탁시켜 칩의 제곱센티미터당 200,000개 세포의 파종 밀도에 해당하는 밀리리터당 500만 세포의 농도를 얻습니다. 다음으로, 잘 혼합된 세포 현탁액 30마이크로리터를 상단 채널로 천천히 피펫팅하고 압력을 가하면서 유창한 동작으로 입구에서 피펫을 제거합니다.현미경으로 파종 밀도를 확인하십시오. 상단 채널 전체에 걸쳐 세포의 균일한 분포가 달성되어야 합니다. 그런 다음 칩을 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 최소 1시간 동안 배양합니다.그 후, 부착되지 않은 세포는 내피 배양 배지로 씻어냅니다. TEER은 배양 기간 동안 모니터링된다는 점을 명심하십시오. 이는 셀이 없는 칩과 셀이 있는 칩의 전기 임피던스 분광법에 대한 임피던스 크기 및 위상 변이 대 주파수를 보여주는 일반적인 회로도 임피던스 스펙트럼입니다.전극의 이중층 커패시턴스, 배양 매체 저항, 세포 장벽 저항 또는 세포막 커패시턴스에 의해 지배되는 4가지 주요 영역이 있습니다. 관심 영역은 세포층의 기여도를 정량화할 수 있는 위치를 나타냅니다. 그리고 이것은 4개의 전극의 6개 조합 모두에서 측정된 저항에서 TEER을 계산하는 공식입니다.여기에 표시된 것은 3일간의 배양 기간 동안 칩에 있는 4개의 BBB의 평균 TEER이 22 플러스 또는 마이너스 1.3옴 제곱센티미터의 고원에 도달한 것입니다. 비교를 위해 블랭크 칩의 데이터가 포함되어 있으며, 이는 셀이 있는 칩의 TEER 값 변화와 비교하여 같은 기간 동안 0옴 제곱센티미터로부터의 한계 변동 및 편차를 보여줍니다. 염색된 핵의 형광 현미경 복제는 PDMS와 삽입물에 표시된 위치에서 멤브레인 모두에서 연속적인 내피 단층을 보여주었습니다.면역형광은 밀접연접 단백질(tight junction protein)의 존재를 드러냈고, 하나는 세포 간의 BBB 특이적 밀착연접(tight junction)이 측정된 TEER을 발생시킨다는 것을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Organs-on-Chips에서 TEER 측정을 위한 통합 전극이 있는 칩의 제조 및 사용에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 혈액-뇌 장벽 연구 분야에서 예를 들어 알츠하이머병의 직접 전달 및 질병 특성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.이 절차에 따라 인간 유래 유도 만능 줄기 세포와 분화된 뇌 내피의 장벽 기능을 모니터링하여 맞춤형 의학에 적용할 수도 있습니다.

fabrication-validation-an-organ-on-chip-system-with-integrated

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 in vitro에서 마우스 뇌 미세혈관 내피 세포에서 경내피 전기 저항(TEER)을 평가하는 방법을 보여줍니다. TEER 값이 높으면 내피 세포 접합이 손상되지 않았음을 나타내고, 활성화된 T 세포가 추가되면 TEER 값이 낮아져 접합 장벽의 파괴를 반영합니다.

In Vitro Blood-Brain barrier 모델에서 경내피 전기 저항 평가

유기 전기 트랜지스터는 생균과 통합 위장관 상피 장벽을 가로 질러 이온 플럭스를 모니터링하는 데 사용된다. 본 연구에서, 칼슘 킬레이트 EGTA (에틸렌 글리콜 - 비스 (베타 - 아미노 에틸 에테르)-N, N, N ', N'-테트라 아세트산의 존재에 의해 유도 타이트 접합 중단, 관련된 이온 플럭스의 증가, 산)가 측정된다.

유기 전기 트랜지스터와 장벽 조직 혼란의 감지

여기, 우리 stretchable, 듀얼 채널의 제작, 기관 수준 기능 체 외업과 위한 기관 칩 미세 세포 문화 장치를 설명 하는 프로토콜을 제시.

Stretchable, 듀얼 채널, 미세 기관 칩의 확장 가능한 제작

여기서, 우리는 경피 / 내피 전기 저항 측정을위한 상업적으로 이용 가능한 젓가락 전극과 함께 사용할 수있는 프로그래밍 가능한 출력 주파수와 저렴한 볼트 암페어 미터를 설정하는 방법을 보여줍니다.

프로그래밍 가능한 출력 주파수를 사용하여 자체 제작 된 볼트 암페어미터를 사용하여 TEER 측정을 수행하는 간단한 접근 방식

이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.

연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

이 프로토콜은 뇌 혈액 장벽의 신뢰할 수 있고 효율적인 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스 대뇌 혈관 내피 세포 bEnd.3를 사용하고 막관통 전기 저항을 측정합니다.

경내피 전기 저항 검출을 통한 bEnd.3 혈관 내피 세포의 장벽 기능 무결성 기록

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

이 프로토콜은 광학 및 전기 양방향 생체 인터페이스를 위한 고급 재료 제조 및 생체 외 쥐 심장 방법을 간략하게 설명하여 생체 전자 연구를 위한 정확한 심장 자극, 기록 및 경색 모델링을 가능하게 합니다.

Bidirectional electrical and Optoelectronic interfaces in healthy and ischemic ex vivo Rat Hearts(건강한 쥐와 허혈성 생체 외 쥐 심장의 양방향 전기 및 광전자 인터페이스)

여기에서는 상피 조직 항상성의 전기기계적 조절을 연구하기 위해 고유한 2층 미세유체 장치를 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 장치는 조직 평면에 수직인 정적 생리학적 전류를 적용하여 세포 간 접착, 증식 및 압출에 영향을 미칩니다. 살아있는 세포 이미징 및 기계적 응력 측정은 이러한 과정의 메커니즘을 보여줍니다.

2층 미세유체 장치를 이용한 조직 항상성의 전기기계적 제어 공개

배우세요 혈뇌장벽 모델에서 TEER를 직접 측정하는 전극 통합 오가노온칩 제조 방법을. 이 기술은 약물 개발 및 맞춤형 의학 연구에 활용됩니다.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

더 많은 동영상 탐색