主动脉-性腺-肾外植体培养体系在发育性造血中的应用

本实验的总体目标是使用主动脉-性腺-中肾外植体培养物来研究造血干细胞发育的关键调节因子。该方法可以帮助回答 HSC 生物学和功能领域中关于如何识别哺乳动物 HSC 发育调节所涉及的因素的关键问题。该技术的主要优点是可以通过 DNA 表达分析以及 HSC 的集落形成能力和重建能力来验证这些调节因子。

通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为 AGM 与躯干区域的周围组织的精确分离需要练习才能掌握。在开始该程序之前，将不锈钢网片放入六孔板的各个孔中，每孔含有 2 毫升新鲜制备的补充氟西汀的培养基。将每个实验孔中一个经过紫外线消毒的 0.65 μL 过滤器放入装有新鲜沸水的玻璃细胞培养皿中，进行两次 3 分钟的洗涤，每次洗涤后将过滤器浸入室温 PBS 容器中 2 分钟。

然后将一个过滤器放在每个孔的气液界面处的每个钢网上。接下来，使用解剖剪刀从胚胎第 11 天怀孕的小鼠身上剥去子宫，并从子宫中收获胚胎。使用解剖剪刀从胚胎体中取出卵黄囊、脐带和内脏。

并小心去除背神经组织和周围的肌肉组织。使用镊子从前肢和后肢去除组织。并将 AGM 区域与胚胎体分开。

然后将每个 AGM 放在每个孔的气液界面的单个过滤器上。将培养物置于 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中。两到三天后，将 AGM 样品转移到含有 200 微升胶原酶的 1.5 毫升微量离心管中，以便在 37 摄氏度下解离约 20 分钟，每 5 分钟摇动一次。

在消化结束时，每个外植体用 200 微升血清终止反应。将每管的全部内容物转移到 24 孔超低吸附板的单个孔中，每孔含有 500 至 600 μL 的 M3434 培养基。用不带针头的 1 毫升注射器混合每个孔中的细胞。

将板放入细胞培养箱中。培养 7 到 10 天后，可以对每个孔内的菌落形成单位的数量进行评分。对于体内 AGM 外植体移植，在 AGM 培养 2 至 3 天后，如刚刚证明的那样，致命地辐射 8 至 10 周龄雄性 C57 黑色 6 只小鼠，具有 9 种格雷性辐射。

4 到 5 小时后，将收获的外植体解离为每个样品 200 μL 胶原酶，如图所示。将所得单细胞悬液的 0.5 比 1 胚胎当量装入每只受体动物的 1 毫升注射器中。将第一只受照射的小鼠放入限制器中，用 75% 乙醇浸泡的棉签擦拭尾巴，以促进尾静脉血管舒张。

将一个注射器的全部内容物静脉注射到扩张的尾静脉中。取出针头后，使用消毒棉签止血。然后将动物放回笼子里，给下一只动物注射。

过继转移后 11 天，脾脏可以固定在 Bouin 溶液中，用于可见脾脏菌落的宏观计数。补充氟西汀的 AGM 培养物显示 Runx1 的表达增加，Runx1 是 mRNA 和蛋白质表达水平 HSC 发展的关键基因。氟西汀还可以显着增加 AGM 中 HSC 的集落形成能力，包括爆发形成单位红细胞、集落形成单位颗粒单核细胞和集落形成单位粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核细胞。

进一步从 AGM 外植体中分离的氟西汀处理的 HSC 的体内移植导致受辐照成年受体动物脾脏中的菌落数量增加。观看此视频后，您应该对如何分离 AGM 和执行 AGM 外植体培养物以识别 AGM 中 HSC 发展的关键调节因子有很好的了解。