Весь геном последовательности Candida glabrata для обнаружения маркеров противогрибковым препаратам

Общая цель данного исследования заключается в проведении полногеномного секвенирования для идентификации мутаций в генах, которые придают устойчивость к противогрибковым препаратам у Candida glabrata в диагностической лаборатории. Полногеномное секвенирование грибов может внести значительный вклад в развитие устойчивости к противогрибковым препаратам. Это позволяет одновременно обнаруживать полногеномные мутации у лекарственно-устойчивых грибов к важным противогрибковым агентам.

Полногеномное секвенирование важных с медицинской точки зрения грибов также может обеспечить обнаружение и мониторинг вспышек, грибковых заболеваний и случаев передачи инфекции в медицинских учреждениях, а также появления видов грибов и клонов, о которых клиницисты должны знать. Эту процедуру будут демонстрировать д-р Ребекка Рокетт и д-р Верлен Тиммс, оба докторанты нашей лаборатории. Для начала подготовьте образцы геномной ДНК из клинических и коммерческих штаммов Candida glabrata.

Затем добавьте пять микролитров количественно определенной ДНК в каждую лунку ранее помеченной свежей 96-луночной тонкостенной пластины с твердой оболочкой. Добавьте в каждую лунку по 10 микролитров буфера для мечения и по пять микролитров буфера для амплификации. Затем с помощью пипетки аккуратно перемешайте образцы и запечатайте пластину клеевым уплотнением, поместите пластину в термоамплификатор и запустите соответствующую программу ПЦР.

Когда проба достигнет 10 градусов по Цельсию, немедленно добавьте пять микролитров нейтрализационного буфера и с помощью пипетки аккуратно перемешайте образцы. Затем укупорьте пластину, и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. По истечении инкубационного периода добавьте в каждую лунку по 15 микролитров Indexing PCR Master Mix.

Расположите инструменты для праймера в штативе для индексных пластин и запишите положение индексов на шаблоне. Затем поместите маркировочную пластину, содержащую PCR Master Mix, на штатив для индексных пластин с индексными пробирками в правильном порядке. Важно расположить индексный капсюль на одной трубке в горизонтальной ориентации, а индексный на двух трубках в вертикальной.

Он основан на порядке и позиции, указанных в шаблоне индекса. Снимите старые колпачки с трубок индексного капсюля и выбросьте их. С помощью многоканальной пипетки добавьте в каждую лунку по пять микролитров индексных праймеров.

Важно выполнять этот шаг осторожно, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами и индексами. Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между индексами, замените каждую из старых крышек индексных пробирок. Наконец, запечатайте пластину и запустите вторую программу ПЦР.

Сначала перенесите продукт ПЦР с маркировочной пластины на глубоколуночный планшет. Нанесите вихревой раствор магнитных шариков и добавьте в каждую лунку по 30 микролитров шариков. Затем взбалтируйте тарелку на вибростенде для микропланшетов и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Поместите пластину на магнитную подставку на две минуты или пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Затем, не двигая пластину, аккуратно выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 200 микролитров 80%-ного этанола. Пока планшет все еще находится на магнитной подставке, инкубируйте в течение 30 секунд, прежде чем сбросить надосадочную жидкость.

Повторите процесс стирки и дайте бусинам высохнуть в течение 15 минут. Снимите пластину с магнитной подставки и добавьте в бусины 52,5 микролитра буфера для ресуспензии. С помощью шейкера с микропластинами перемешивайте пластину в течение двух минут со скоростью 1 800 об/мин.

Затем, после того как шейкер остановится, выдержите тарелку при комнатной температуре в течение двух минут. После окончания инкубационного периода поместите планшет на магнитную подставку до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Наконец, с помощью многоканальной дозатора переведите 50 микролитров прозрачной надосадочной жидкости из лотка для очистки на свежую пластину с твердой оболочкой.

Сначала следуют реагенты для нормализации библиотеки и переносят 20 микролитров прозрачной надосадочной жидкости с твердой оболочки на новую глубоколуночную пластину. Добавьте 45 микролитров магнитной суспензии в каждую лунку глубоколуночной пластины и используйте герметик для пластин для герметизации пластины. Затем перемешивайте пластину на вибростенде с микропластинами при 1 800 об/мин в течение 30 минут.

Поместите пластину на магнитную подставку на две минуты, пока надосадочная жидкость не выйдет. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость и выбросьте надосадочную жидкость в соответствующий контейнер для опасных отходов. Затем снимите пластину с магнитной подставки и используйте 45 микролитров буфера для промывки шариков.

Перемешайте тарелку на вибростенде для микропланшетов и поставьте тарелку на магнитную подставку на две минуты. После того, как надосадочная жидкость очистится, выбросьте надосадочную жидкость и снимите пластину с магнитной подставки. Повторите процесс промывки с буфером для промывки еще раз.

Перед тем как снять пластину с магнитной подставки, добавьте NaOH в каждую лунку. Затем перемешивайте пластину на вибростенде с частотой вращения 1 800 об/мин в течение пяти минут, прежде чем поместить пластину на магнитную подставку, пока жидкость не станет прозрачной. Добавьте по 30 микролитров элюирующего буфера в каждую лунку нового 96-луночного тонкостенного планшета с жесткой оболочкой.

Наконец, перенесите по 30 микролитров надосадочной жидкости из нормализующей пластины в каждую из лунок, содержащих буфер для элюирования. Теперь окончательная нормализованная библиотечная пластина готова к секвенированию в дальнейших экспериментах. Изучено 13 изолятов C.glabrata, полученных до и после противогрибковой терапии, состоящих из C.glabrata ATCC 90030 и двенадцати изолятов из клинической лаборатории.

Минимальная ингибиторная концентрация, или МИК, была получена для каждого изолята для девяти противогрибковых препаратов. В этой таблице перечислены значения MIC для каждого условия испытания изолята противогрибкового препарата. Присутствие SNP в генах, придающих устойчивость в изоляте, коррелировало с повышенным MIC in vitro в отношении противогрибковых препаратов.

В этой таблице обобщены позиции SNP в клинических изолятах C.glabrata и препараты, к которым гены придают устойчивость. После просмотра этого видео зрители могут воспроизвести этот метод в условиях диагностической лаборатории для аккредитации в области секвенирования всего генома. В нем освещаются важные этапы подготовки библиотеки ДНК и основные точки контроля качества для получения точных и воспроизводимых результатов.