Metabolische Kennzeichnung
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Overview
Metabolische Kennzeichnung wird verwendet, um die Sonde die biochemischen Veränderungen und Änderungen, die in einer Zelle auftreten. Dies wird erreicht durch den Einsatz von chemischen Analoga, die die Struktur des natürlichen Biomoleküle zu imitieren. Zellen nutzen Analoga in ihrer endogenen biochemischen Prozessen, Herstellung von Verbindungen, die beschriftet werden. Das Label ermöglicht die Einbindung von Erkennung und Affinität-Tags, die dann verwendet werden, um mit anderen biochemischen analytischen Techniken, wie SDS-PAGE und NMR Stoffwechselwege aufzuklären.
Dieses Video stellt die Konzepte der metabolischen Kennzeichnung und zeigen zwei allgemeine Verfahren. Die erste verwendet Isotopen-Etikettierung, um die Phosphorylierung eines Proteins zu charakterisieren. Die zweite Abdeckungen photoreaktiven Kennzeichnung zur Charakterisierung von Protein-Protein Interaktion innerhalb einer Also drei Anwendungen der metabolischen Kennzeichnung werden vorgestellt: Kennzeichnung Pflanzenmaterial, RNA zur Messung der Kinetik Kennzeichnung und Etikettierung Glykoproteinen bei der Entwicklung von Embryonen.
Metabolische Kennzeichnung wird verwendet, um die Maschinerie einer Zelle untersuchen. Dies erfolgt mit chemischen Analoga, Sonde, die biochemischen Veränderungen und Änderungen, die auftreten. Dieses Video zeigt die Grundsätze der metabolischen etikettieren, typische Isotopen und photoreaktiven Kennzeichnung Verfahren und einige Anwendungen.
Metabolische Kennzeichnung kann mit eine Reihe von Strategien durchgeführt werden. Hier beschreiben wir Isotopen, Photoreaktive und Bio-orthogonal zu beschriften.
Isotopen Kennzeichnung erfolgt über strukturelle Analoga, die zu ihren natürlichen Gegenstücken chemisch identisch sind, aber selten Isotope integriert ihre Struktur. In dieser L-Lysin-Analog werden die Kohlenstoff und Stickstoff-Atome durch Kohlenstoff-13 und Stickstoff-15 ersetzt. Zellen in Anwesenheit von Isotopen Analoga kultiviert werden sie in ihrer biochemischen Struktur integrieren. Metaboliten werden aus den Zellen gesammelt und gereinigt für die Analyse. Proben mit stabilen Isotope werden analysiert, mit Techniken wie Massenspektrometrie oder NMR-Spektroskopie. Proben mit radioaktiven Etiketten werden analysiert, mit liquid funkeln zählen und x-ray-Filme, die in der isotopischen Kennzeichnung Protokoll nachgewiesen werden.
Photoreaktive Etiketten sind funktionelle Gruppen integriert Proteine, die stabil bis UV-Licht ausgesetzt sind. Die funktionelle Gruppe bildet eine reaktive Radikale, die das nächste Protein bindet. Ein typisches Beispiel, L-Foto-Leucin, enthält einen Diazirine-Ring, der einem photoreaktiven Vernetzer ist. Im Gegensatz zu den Isotopen zu beschriften, gibt es einige chemische Unähnlichkeit zwischen Foto-reaktive chemische Analoga und ihre natürlichen Pendants. Zellen können über Analoga bevorzugt Naturstoffe enthalten. Daher ist es wichtig, führen Sie Foto-reaktive Kennzeichnung in Medium frei von der Verbindung wird nachgeahmt. Wenn ultraviolette Strahlung ausgesetzt, werden die Foto-reaktiven Gruppen in einem beschrifteten Protein instabil und hochreaktive, wodurch es zu vernetzen mit interagierenden Proteine, erstellen ein Protein Komplex. Vernetzte komplexe wirken wie Momentaufnahmen, die dann mit SDS-PAGE und Massenspektrometrie Methoden analysiert werden können. Dies gibt Einblicke in welche Reaktionen in den Stoffwechselweg durch die Identifizierung Reaktion Arten auftreten und wie sie interagieren durch die Bestimmung Bindungsstellen.
Bioorthogonal-Kennzeichnung-Strategien nutzen Analoga mit kleinen funktionellen Gruppen, die wenig bis gar keine Reaktivität mit natürlichen Biomoleküle zu haben. Azides sind beispielsweise kleine funktionelle Gruppen, deren Reaktivität orthogonal zur biochemischen Reaktionen werden soll. In der Staudinger-Ligatur greift eine Phosphin-Gruppe die Azido-Gruppe. Daraus ergibt sich ein Übergangszustand, der Atropisomerie mit einer nahe gelegenen Ester, was zu einem Amin-gebundenen Liganden reagiert. Bioorthogonal funktionelle Gruppen integriert Biomoleküle können mit Erkennung Tags wie fluoreszierende Funktionsgruppen ligiert und Affinität Stichwörter wie Antigene.
Nun, einige Konzepte und Strategien für die metabolische Bezeichnung diskutiert worden sind, schauen Sie sich bitte an den Prozess im Labor.
Der erste Schritt in einem metabolischen Kennzeichnung Experiment ist das Protein des Interesses zu sammeln. Zu diesem Zweck werden Zellen auf einem Teller angebaut, und eine Ausdruck-Methode wird verwendet, um die Synthese des gewünschten Proteins zu fördern. In diesem Beispiel Leucin-reiche wiederholen Kinasen oder LRRK ausgedrückt. Binatrium Phosphat, mit radioaktivem Phosphor-32, dient als die analogen. Angemessene Maßnahmen zum Schutz vor ionisierender Strahlung. Dazu gehören ein Arbeitsbereich einrichten, angemessene Schutzausrüstung tragen und auf radioaktive Kontamination überprüft. Sicherheitsmaßnahmen getroffen haben, ist das Medium mit der isotopischen Analoga bereit. Das Medium aus der Kultur ist entfernt und ersetzt mit einem mit der isotopischen chemische Analoga und dann bebrütet. Nach Inkubation sind die Zellen lysiert. Die lysate gesammelt und gereinigt.
Nach der Reinigung werden Proteine aufgelöst, mit SDS-PAGE und dann auf einer PVDF-Membran übertragen. Autoradiographie wird durchgeführt, indem man die Membran um Röntgen-Film und mit einem Phosphor Imager gemessen. Westliche Beflecken wird verwendet, um relative Proteingehalt in der PVDF-Membran zu messen. In diesem Beispiel wiederholen die Phosphorylierung Ebenen der Leucin-reiche Kinasen in 293T synthetisiert, die Zellen gemessen wurden. Die Autoradiogram zeigt wieviel Phosphor wurde in das Protein aufgenommen. Westliche Beflecken, erläutert die Ebenen der LRRK Proteine. Bildanalyse-Software dient zur quantitativen Daten der Phosphorylierung Ebenen der Proteine zu erhalten.
In diesem nächsten Verfahren zeigt photoreaktiven beschriften. Erstens sind die Zellen vorbereitet und kultiviert. Die photoreaktiven Analog ist hinzugefügt, um die Zellen in der Mitte des Log-Phase und inkubiert. In diesem Verfahren wird p-Benzoylphenylalanine verwendet. Proben werden in Abständen gesammelt und auf Eis gelegt. Die Proben werden dann ausgesetzt, um Schnappschüsse von der biochemischen Bahnen im Laufe der Zeit zu erhalten. Interessierender Proteine werden dann gereinigt und mit SDS-PAGE aufgelöst.
Eine Photoreaktive Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die mit dem Protein des Interesses zu interagieren. Immunodetection mit Western Blot zeigt Protein-Bands, die höheren Molekulargewicht Proteinen anzugeben sind im bestrahlten Proben vorhanden. Diese sind von Vernetzung durch Protein-Protein Wechselwirkung auftritt während der UV-Bestrahlung.
Nun, da wir metabolische Kennzeichnung Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der Möglichkeiten, die der Prozess verwendet wird.
Metabolische Kennzeichnung Konzepte erweiterbar auf vielzellige Organismen. Pflanzen wachsen in einer geschlossenen Umgebung reich an stabile Isotope, produzierten beschrifteten Pflanzenmaterial. Kohlendioxid mit Kohlenstoff-13 ist das Gehäuse, während Stickstoff-15 hinzugefügt, die reiche Dünger verwendet wird. Das daraus resultierende geerntete Pflanzenmaterial kann Fragen zu Kohlenstoff und Stickstoff aus dem Ökosystem Radsport beantworten helfen.
Kennzeichnung ermöglicht die Trennung der neugebildete RNA von älteren RNS. Durch die Veränderung der Ausgangskonzentration des Analog, kann die Kinetik der neuen RNS-Synthese bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konzentration von 4-Thiouridine beeinflusst, wie viel neue RNA transkribiert wird. Darüber hinaus können Aufnahme Preise des Labels in RNA direkt mit einem Spektrophotometer quantifiziert werden.
Mit Biorthogonal Click-Chemie, können Glykoproteinen in ein Zebrafisch-Embryonen beschriftet werden. Die Eizellen werden mit einer Kennzeichnung Verbindung injiziert, die Ergebnisse in Alkinen Etiketten auf den Glykoproteinen. Glykanen in die Larven werden dann zu einer Farbstoff-Verbindung bei der gewünschten Entwicklung ligiert. Die Glykoproteinen in den Embryonen werden dann abgebildet. Glykane produziert zu unterschiedlichen Zeitpunkten können identifiziert werden, durch Markierung mit unterschiedlichen Farben in den verschiedenen Phasen der Entwicklung des Embryos.
Sie haben nur Jupiters Video auf metabolische Kennzeichnung angesehen. Dieses Video beschreibt die Konzepte hinter metabolische Kennzeichnung und ihre Strategien, ging über zwei allgemeine Verfahren und fallen einige der Anwendungen von den Techniken.
Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Disclosures
Transcript
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
Now that we’ve reviewed metabolic labeling procedures, let’s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
You’ve just watched JoVE’s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
