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Biochemistry
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Metabolic Labeling
  • 00:00Overview
  • 00:31Principles of Metabolic Labeling
  • 03:39Isotopic Labeling Procedure
  • 05:30Photoreactive Labeling Procedure
  • 06:31Applications
  • 08:06Summary

Marcatura metabolica

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Overview

L’etichettatura metabolica viene utilizzata per sondare le trasformazioni e le modifiche biochimiche che si verificano in una cellula. Ciò si ottiene utilizzando analoghi chimici che imitano la struttura delle biomolecole naturali. Le cellule utilizzano analoghi nei loro processi biochimici endogeni, producendo composti che sono etichettati. L’etichetta consente l’incorporazione di tag di rilevamento e affinità, che possono quindi essere utilizzati per chiarire le vie metaboliche utilizzando altre tecniche analitiche biochimiche, come SDS-PAGE e NMR.

Questo video introduce i concetti di etichettatura metabolica e mostra due procedure generali.  Il primo utilizza l’etichettatura isotopica, per caratterizzare la fosforilazione di una proteina. Il secondo copre un’etichettatura fotoreattiva per caratterizzare l’interazione proteina-proteina all’interno di un Vengono presentate anche tre applicazioni di etichettatura metabolica: etichettatura del materiale vegetale, etichettatura dell’RNA per misurare la cinetica ed etichettatura dei glicani negli embrioni in via di sviluppo.

L’etichettatura metabolica viene utilizzata per studiare il meccanismo di una cellula. Ciò si ottiene utilizzando analoghi chimici per sondare le trasformazioni e le modifiche biochimiche che si verificano. Questo video mostrerà i principi dell’etichettatura metabolica, le tipiche procedure di etichettatura isotopica e fotoreattiva e alcune applicazioni.

L’etichettatura metabolica può essere condotta utilizzando una serie di strategie. Qui descriveremo l’etichettatura isotopica, fotoreattiva e bio-ortogonale.

L’etichettatura isotopica viene eseguita utilizzando analoghi strutturali che sono chimicamente identici alle loro controparti naturali, ma hanno isotopi non comuni incorporati nella loro struttura. In questo analogo della L-lisina gli atomi di carbonio e azoto sono sostituiti con carbonio-13 e azoto-15. Le cellule coltivate in presenza di analoghi isotopici li incorporeranno nelle loro strutture biochimiche. I metaboliti vengono raccolti dalle cellule e purificati per l’analisi. I campioni con isotopi stabili vengono analizzati utilizzando tecniche come la spettrometria di massa o la spettroscopia NMR. I campioni con etichette radioattive vengono analizzati utilizzando il conteggio a scintillazione liquida e le pellicole a raggi X, che saranno dimostrate nel protocollo di etichettatura isotopica.

Le etichette fotoreattive sono gruppi funzionali incorporati nelle proteine, che sono stabili fino a quando non vengono esposte alla luce ultravioletta. Il gruppo funzionale forma un radicale reattivo, che si lega alla proteina più vicina. Un esempio comune, L-foto-leucina, contiene un anello di diazirina, che è un reticolante fotoreattivo. In contrasto con l’etichettatura isotopica, c’è una certa dissomiglianza chimica tra gli analoghi chimici foto-reattivi e le loro controparti naturali. Le cellule possono preferenzialmente incorporare composti naturali rispetto ad analoghi. Pertanto, è importante eseguire l’etichettatura foto-reattiva in un mezzo privo del composto imitato. Una volta esposti alle radiazioni ultraviolette, i gruppi foto-reattivi in una proteina etichettata diventano instabili e altamente reattivi, facendola cross-linkare con le proteine interagenti, creando un complesso proteico. I complessi reticolati fungono da istantanee che possono quindi essere analizzate utilizzando i metodi SDS-PAGE e spettrometria di massa. Ciò fornisce informazioni su quali reazioni si verificano nella via metabolica identificando le specie di reazione e come interagiscono determinando i siti di legame.

Le strategie di etichettatura bioortogonale utilizzano analoghi con piccoli gruppi funzionali che hanno poca o nessuna reattività con le biomolecole naturali. Ad esempio, gli azidi sono piccoli gruppi funzionali, la cui reattività si dice ortogonale alle reazioni biochimiche. Nella legatura di Staudinger, un gruppo di fosfine attacca il gruppo azido. Ciò produce uno stato di transizione che reagisce intramolecolare con un estere vicino, risultando in un ligando legato all’ammina. I gruppi funzionali bioortogonali incorporati nelle biomolecole possono essere legati con tag di rilevamento come gruppi funzionali fluorescenti e tag di affinità come antigeni.

Ora che sono stati discussi alcuni concetti e strategie per l’etichettatura metabolica, diamo un’occhiata al processo in laboratorio.

Il primo passo in un esperimento di etichettatura metabolica è quello di raccogliere la proteina di interesse. Per fare questo, le cellule vengono coltivate su un piatto e viene utilizzato un metodo di espressione per promuovere la sintesi della proteina desiderata. In questo esempio, vengono espresse chinasi ripetute ricche di leucina, o LRRK. Il fosfato disodico, contenente fosforo-32 radioattivo, è usato come analogo. Devono essere prese misure adeguate per proteggersi dalle radiazioni ionizzanti. Ciò include la creazione di un’area di lavoro, l’uso di adeguati dispositivi di protezione e il controllo della contaminazione radioattiva. Una volta adottate le misure di sicurezza, viene preparato il mezzo contenente gli analoghi isotopici. Il mezzo dalla coltura viene rimosso e sostituito con uno contenente gli analoghi chimici isotopici e quindi incubato. Dopo l’incubazione, le cellule vengono lizzate. Il lisirato viene raccolto e purificato.

Dopo la purificazione, le proteine vengono risolte utilizzando SDS-PAGE e quindi trasferite su una membrana PVDF. L’autoradiografia viene eseguita esponendo la membrana alla pellicola a raggi X e misurata utilizzando un imager al fosforo. Il western blotting viene utilizzato per misurare i livelli relativi di proteine nella membrana PVDF. In questo esempio sono stati misurati i livelli di fosforilazione delle chinasi ripetute ricche di leucina sintetizzate in cellule 293T. L’autoradiogramma mostra quanto fosforo è stato incorporato nella proteina. Western blotting chiarisce i livelli delle proteine LRRK. Il software di analisi delle immagini viene utilizzato per ottenere dati quantitativi dei livelli di fosforilazione delle proteine.

In questa procedura successiva, viene dimostrata l’etichettatura fotoreattiva. In primo luogo, le cellule vengono preparate e coltivate. L’analogo fotoreattivo viene aggiunto alle cellule nella fase mid-log e incubato. In questa procedura viene utilizzata la p-benzoilfenilalanina. I campioni vengono raccolti a intervalli e messi su ghiaccio. I campioni vengono quindi esposti per ottenere istantanee dei percorsi biochimici nel tempo. Le proteine di interesse vengono poi purificate e risolte utilizzando SDS-PAGE.

Una strategia di etichettatura fotoreattiva è stata utilizzata per identificare i composti che interagiscono con la proteina di interesse. L’immunodetezione con Western blotting mostra bande proteiche che indicano che nei campioni irradiati sono presenti proteine a più alto peso molecolare. Questi sono da cross-linking a causa dell’interazione proteina-proteina che si verifica durante l’irradiazione UV.

Ora che abbiamo esaminato le procedure di etichettatura metabolica, diamo un’occhiata ad alcuni dei modi in cui viene utilizzato il processo.

I concetti di etichettatura metabolica possono essere estesi agli organismi multicellulari. Le piante vengono coltivate in un ambiente sigillato, ricco di isotopi stabili per produrre materiale vegetale etichettato. L’anidride carbonica contenente carbonio-13 viene aggiunta all’involucro, mentre viene utilizzato fertilizzante ricco di azoto-15. Il materiale vegetale raccolto risultante può aiutare a rispondere alle domande sul ciclo del carbonio e dell’azoto dall’ecosistema.

L’etichettatura consente la separazione dell’RNA appena sintetizzato dall’RNA più vecchio. Modificando la concentrazione iniziale di analogo, è possibile determinare la cinetica della sintesi di nuovo RNA. I risultati mostrano che la concentrazione di 4-tiouridina influisce sulla quantità di nuovo RNA trascritto. Inoltre, i tassi di incorporazione dell’etichetta nell’RNA possono essere quantificati direttamente con uno spettrofotometro.

Utilizzando la chimica dei clic biortogonali, i glicani in un embrione di pesce zebra possono essere etichettati. Le uova vengono iniettate con un composto di etichettatura che si traduce in etichette alchine sui glicani. I glicani nelle larve vengono quindi ligati a un composto colorante nella fase di sviluppo desiderata. I glicani negli embrioni vengono quindi ripresi. I glicani prodotti in diversi punti temporali possono essere identificati etichettando utilizzando colori diversi in diverse fasi dello sviluppo dell’embrione.

Hai appena visto il video di JoVE sull’etichettatura metabolica. Questo video ha descritto i concetti alla base dell’etichettatura metabolica e le loro strategie, ha esaminato due procedure generali e ha coperto alcuni degli usi delle tecniche.

Grazie per l’attenzione!

Procedure

L’etichettatura metabolica viene utilizzata per sondare le trasformazioni e le modifiche biochimiche che si verificano in una cellula. Ciò si ottiene utilizzando analoghi chimici che imitano la struttura delle biomolecole naturali. Le cellule utilizzano analoghi nei loro processi biochimici endogeni, producendo composti che sono etichettati. L’etichetta consente l’incorporazione di tag di rilevamento e affinità, che possono quindi essere utilizzati per chiarire le vie metaboliche utilizzando altre tecniche analitiche biochimiche, come SDS-…

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Transcript

Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.

Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.

Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.

Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.

Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.

Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.

The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.

After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.

In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.

A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.

Now that we’ve reviewed metabolic labeling procedures, let’s look at some of the ways the process is used.

Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.

Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.

Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.

You’ve just watched JoVE’s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.

Thanks for watching!

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Cite This
JoVE Science Education Database. JoVE Science Education. Metabolic Labeling. JoVE, Cambridge, MA, (2023).

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