Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Bu prosedürün genel amacı, akut miyeloid lösemide ve hasta kaynaklı ksenogreftlerde lösemi kök hücrelerini tanı ve tedavi takibinde akış sitometrisi ile tahmin etmektir. Bu yöntem, akut miyeloid lösemide akış sitometrisi ile lösemi kök hücrelerinin kantitatif değerlendirmesinin klinik önemi gibi hematoloji/onkoloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yaygın olarak kullanılan antikorlara sahip çoğu hematoloji/onkoloji laboratuvarına uygulanabilir olmasıdır.

Bu prosedür, doktora sonrası Thomas, yüksek lisans öğrencisi Fanny ve laboratuvarımdan bir mühendis olan Adeline tarafından gösterilecektir. Başlamak için, anti-koagülan EDTA'nın mililitresinde 1.8 miligram içeren tüplerde de novo AML'den iki mililitre kemik iliği toplayın. Önce kemik iliğini üç hacim PBS'de seyrelterek mononükleer hücreleri kırmızı kan hücrelerinden ve granülositlerden izole edin.

Daha sonra, bir hacim ficol'u bir hacim seyreltilmiş kemik iliği ile dikkatlice kaplayın. Yoğunluk gradyanını 300 g'da ara vermeden 30 dakika döndürün. Daha sonra, tek çekirdekli hücrelerin beyaz kabarık kaplama tabakasını yeni bir steril tüpe aktarın.

Serum bileşenlerini kirleten süpernatanları çıkarmak için, 10 mililitre PBS ekleyin ve yıkamayı tekrarlamadan önce hücreleri beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Hücre peletine iki mililitre lizis tamponu ekleyerek kırmızı kan hücrelerini parçalayın ve yavaşça girdap yapın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Hücreleri 300 g'da beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Ardından, hücreleri yıkamak için PBS kullanın. Blast hücrelerini metin protokolüne göre kemik iliğinden izole ettikten sonra, laminer bir akış başlığı altında, koşullandırılmamış bir NSG faresini bir kısıtlama cihazına yerleştirin ve kuyruk damarına beş kez 10 ila altıncı AML blast hücresi enjekte edin.

Fareyi, geleneksel ve özel patojen içermeyen koşullar altında havalandırmalı ayrı bir kafese geri koyun. Her iki haftada bir, 60 mikrolitre kan almak için hematokrit kılcal damarlı bir submandibular toplama yöntemi kullanın. Kılcal damarı beş mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından steril bir gazlı bezle kanamayı durdurmak için hafif bir baskı uygulayın.

Tüpe bir mililitre lizis tamponu ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı çıkardıktan sonra,% 10 BSA, üç mikrolitre anti-insan CD45 FITC ile 100 mikrolitre PBS ekleyin, 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücre peletini PBS'de iki kez, iki mililitre,% 10 BSA ile yıkayın ve beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Her iki haftada bir, insan ve murin CD45 ekspresyonunun kimerizm analizi ile aşılamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanın.

Patlama sayısı %70'in üzerinde olduğunda veya ciddi klinik hastalık belirtileri gözlendiğinde, hayvanı kurban edin ve daha önce tarif edildiği gibi tibiaları ve femurları yıkamak için PBS kullanarak ezilmiş bir dalaktan ve kemik iliğinden mononükleer patlama hücreleri toplayın. Panel boyamayı gerçekleştirmek için, konjuge antikorları insan primer veya hastadan türetilmiş ksenogreft veya PDX numuneleri ile birleştirin ve tüpleri girdaplayın. Daha sonra, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin.

Hücreleri yıkamak için iki mililitre PBS kullanarak bağlanmamış antikorları çıkarın. Hücreleri 450 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin, ardından akış sitometrisi analizine ve MRD izlemeye devam edin. Akış sitometrisi ile sitoplazmik belirteçlerin zarını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmek için optik hizalamayı doğrulayın.

3D sisteminin uygun şekilde ayarlanması ve stomazin kalibrasyonu kullanılarak optik hassasiyet ve stomatizasyon her gün atıyor. CD38 için kapıları ayarlamak için normal kemik iliği kullanın. En az 500.000 olay gereklidir ve her akış çalışmasının düzenli ve homojen olduğu doğrulanır.

Ek olarak, çiftlerin yanı sıra ölü hücreler ve hücre kalıntıları da elimine edilir. İmmatür hematopoetik hücreler CD45 ara, SSC düşük olarak tanımlanır. Ve CD38 pozitif kontrol veya hematogonlar, CD19 / CD38 çift pozitiftir.

Daha sonra P8 veya CD38 pozitif, P7 veya CD38 ara ve P6 veya CD38 negatif tanımlanır. P6 hücreleri ayrıca HSC, MPP ve LSC'ye bölünebilir. Normal bir kemik iliği olduğu için LSC negatiftir.

Multiparametrik akım sitometrisi kullanılarak, CD34 pozitif, CD38 negatif blast fraksiyonunun PDX'te tanısal hasta örneğine göre daha yüksek olduğu bulundu. İlginç bir şekilde, PDX'te birincil hasta örneğine kıyasla daha yüksek bir varsayılan LSC yüzdesi bulundu, bu da bu fare modelinde hematolojik dokularda malign progenitör hücrelerin olası bir zenginleşmesini düşündürdü. İki farklı hasta örneğinde blast progenitör popülasyonları karşılaştırıldığında, CD34 pozitif, CD38 negatif fraksiyonu ilk hastada tanı başında %0.06 iken ilk tedavi takibinde %3.33'e yükselmiştir.

Buna karşılık, CD34 pozitif, CD38 negatif fraksiyonu ikinci hastada tanıda %7.8'den ilk tedavi takibinde %2.27'ye düştü. Buna göre, varsayılan LSC fraksiyonu ilk hastada tanıda %0'dan tedavi takibinde %0.65'e yükselmiş, ikinci hastada tanıda %6.57'den tedavi takibinde %1.44'e düşmüştür. Moleküler belirteçler olarak birinci hastadaki NPM1 mutasyonu ve ikinci hasta için CBF-beta MYH11 gen füzyonu kullanan minimal rezidüel hastalık veya MRD izlemesi, moleküler MRD'nin ilk hastada ikinci hastaya kıyasla daha az azaldığını gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, akış sitometrik ayarlarını ve CD38 ölçümünü doğrulamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, fonksiyonel lösemi kök hücre değerlendirmesi gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrik hücre sıralaması gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, hasta kaynaklı ksenogreftlerde hasta örneklerinde lösemi kök hücrelerinin nasıl tespit edileceğini ve miktarının nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Hasta numuneleri ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken GOP yönergeleri ve kurumsal güvenlik prosedürleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.