Name: Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Einzelzell-Fluoreszenzabbildung zirkadianer Uhren in Drosophila-Larvengehirnen. Diese Methode ermöglicht die Langzeitbeobachtung molekularer Rhythmen in spezifischen Neuronenpopulationen.

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Wir danken Michael Rosbash für seine Betreuung und Unterstützung während der Anfangsphase der Entwicklung dieser Methode. Diese Arbeit wurde vom JST PRESTO-Programm des Schweizer Nationalfonds (31003A_149893 und 31003A_169548), der Europäische Forschungsrat (ERC-StG-311194), Novartis Stiftung für medizinisch-biomedizinische Forschung (13A39) und der Universität Genf finanziert. .

1. Vorbereitung der Stammlösungen unter einem Kultur-Haube
<ol><li>Bereiten Sie 400 mL 1 x Schneider aktives Medium (SAM) optimiert für ex-Vivo -Kultur der Larven Gehirne (geändert von Referenz-24,-25) (Tabelle 1). Aliquot 5 mL und Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff (LN2), Lagerung bei - 80 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 x Dissecting Kochsalzlösung (DSS) durch Verdünnung 10-fach-Stammlösung (geändert von Referenz-26) (Tabelle 2).</li>
	<li>Aliquoten Fibrinogen, 10 mg und bei 4 ° C für den einmaligen Gebrauch. Achtung: Wiegen Sie Fibrinogen unter Laminar-Flow, mit Handschuhen, da es schädlich ist.</li>
	<li>Thrombin-Stammlösung in SAM vorbereiten (1500 NIH Einheit/mg) und Aliquoten, 10 µL, Blitz in LN2 Einfrieren und halten bei-80 ° C. Achtung: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Thrombin als schädlich gilt.</li>
	<li>Aliquoten Stammlösung von 100 x Penicillin-Streptomycin. Halten Sie bei-20 ° C.</li>
	<li>Schneiden Sie Kreise aus Polytetrafluorethylen (PTFE) Membran (siehe Materialtabelle) auf die Größe, die das Innere einer Glasschale unten passt. Spülen Sie sie in 70 % EtOH und dann in den Autoklaven dH2O. entkeimen und trocken unter Laminar-Flow mit UV. Halten Sie in eine sterile Petrischale. Einmaligen Gebrauch. Hinweis: PTFE ist eine poröse flexible Membran, die Gasaustausch ermöglicht und verhindert, dass Medium verdampfen während Langzeitaufzeichnung.</li>
</ol>2. Time-Lapse Mikroskopie-Setup
Hinweis: Die folgende Konfiguration ist für ein Tandem Scanner invertiert confocal Mikroskop (siehe Materialtabelle) mit einem Resonanz-Scanner (8.000 Hz) ausgestattet. Das System beinhaltet einen hochempfindliche Photomultiplier-Detektor, der zusammen mit der Resonanz-Scanner Phototoxizität und Immunofluoreszenz verhindert. Temperatur und Luftfeuchtigkeit kontrolliert in einer Klimakammer Mikroskop (siehe Materialtabelle), das deckt den Großteil des Mikroskops.
<ol><li>Legen Sie eine Bühne-Top feuchte Kammer.</li>
	<li>Schalten Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu equilibrate die Mikroskop Kammer bis 25 ° C und 80 % Luftfeuchtigkeit Controller.</li>
	<li>Zum Durchführen von Experimenten in ständige Dunkelheit (DD) decken Sie die Mikroskop-Klimakammer mit einem undurchsichtigen Tuch (es sei denn, die Mikroskop Kammer aus lichtundurchlässigem Material besteht).</li>
	<li>Wenn ein Eintauchen in Wasser Ziel verwenden, positionieren Sie einen Wasserspender Immersion Micro auf das Ziel und Programm ein Protokoll mit der Autoimmersion-Ziel-Controller-Software um Wasser mit einer konstanten Rate während der Time-Lapse Bildgebung zu verzichten. Hinweis: Eintauchen in Wasser Ziele zusammen mit einem Wasserspender oder trockenen Objektiv sind für langfristige live Imaging, empfohlen, da andere Art von Medium eintauchen austrocknen würde.</li>
	<li>Platzhalter eine Petrischale auf der Bühne, in die feuchte Kammer.</li>
	<li>Starten Sie die Mikroskop-Software, und wählen Sie den resonanten Scanner-Modus aus der ersten Dialogbox. Wählen Sie "OK" auf die Bühne, wenn Sie aufgefordert werden zu initialisieren. Gehen Sie zur Registerkarte "Konfiguration", Hardware-Konfiguration auf die relevanten Laserlinien wechseln.</li>
	<li>Gehen Sie zur Registerkarte "Acquire" und XY-Panel bidirektionalen Modus auswählen und einstellen Bild Aufnahmeparameter. Hinweis: Das beschriebene bildgebende Setup hier vorgestellten ( Film 1,Abbildung 2und Abbildung 3 ) ist optimiert für zirkadianen Ausdruck der spezifischen fluoreszierenden Reporter zu beobachten. Die folgenden Parameter wurden ausgewählt, um unseren Anforderungen am besten passen: 40 X Wasser eintauchen Ziel, 8 X Line Durchschnitt mit 512 × 512 Auflösung. Für mehrfarbige Bildgebung, fortlaufende Bildaufnahme ist erforderlich, wenn die Emissionswellenlänge von einem Fluorophor und die Erregung Wellenlänge eine andere Überlappung (hier: Wellenlängen gelb fluoreszierende Protein (YFP) Emission und Tomate Erregung Überlappung). Wählen Sie die sequenziellen Modus "zwischen den Stapel", wie es die schnellste ist und die Bewegung der Uhr Neuronen ist beim Erwerb eines Z-Stack zu vernachlässigen. Mikroskopie-Einstellungen sollten an das Ziel, jedes Experiment angepasst werden.</li>
</ol>3. Setup der Larven Gehirn Explant Kultur
Hinweis: Die ganze Prozedur von Dissektion zur Einbettung des Gehirns Explantaten dauert ca. 30 min.
<ol><li>
Vorbereitung der Reagenzien unter einem Kultur-Haube.
	<ol>
<li>Tauen Sie ein Aliquot von Thrombin auf und bei Zimmertemperatur aufbewahren Sie, bis der einbettenden Schritt (Schritt 3.3). Einmaligen Gebrauch.</li>
		<li>Tauen Sie schnell eine Aliquote von SAM bei 37 ° C und halten Sie auf dem Eis für den einmaligen Gebrauch.</li>
		<li>Eine 10 mg aliquoten von Fibrinogen, 10 mg/mL SAM hinzufügen, wechseln Sie sanft und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten und während der einbettenden Schritt (Schritt 3.3). Einmaligen Gebrauch. Hinweis: Inkubieren Sie nicht, die Fibrinogen-Lösung mehr als 2 h, wie es beginnt zu polymerisieren.</li>
		<li>Eine aliquote 100 X Lager Penicillin-Streptomycin Auftauen. Bereiten Sie 2,5 mL von SAM mit 1 x Penicillin-Streptomycin (SAM/Antibiotika). Bei Zimmertemperatur aufbewahren. Hinweis: Laden die restlichen 100 X Lager Penicillin-Streptomycin bei 4 ° C bis zu 1 Monat.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Aliquote von 500 µL aus der verbleibenden SAM. Halten Sie auf dem Eis.</li>
		<li>Für langfristige Belichtung einfetten autoklaviert Vakuum das Kunststoffteil der Unterseite der unteren Glasschale (Abbildung 1A) und unter Laminar-Flow mit UV-Sterilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissektion des zentralen Nervensystems und ventraler Nervenstrang.
	<ol>
<li>Reinigen Sie die Zange und 2 x drei-Well Dissektion Glasschalen mit 70 % EtOH. Gießen Sie 400 µL des DSS in 4 Vertiefungen und 400 µL von SAM in einen Brunnen. Halten Sie auf dem Eis.</li>
		<li>Fliege Larven-haltigem Medium aushöhlen Sie und wählen Sie nicht wandern 3. Instar Larven (L3) mit der Pinzette. Spülen Sie sie nacheinander in 2 DSS gefüllten Brunnen. Halten sie in der 3. DSS gefüllten Brunnen auf Eis, das die Larven anesthetizes. Hinweis: L3 dauert ca. 2 Tage bei 25 ° C. Das Gehirn in physiologisch relevanten Zeitrahmen zu beobachten, die wir nicht wandern L3 Larven verwenden. Andere Untergruppen von Uhr Neuronen, wie l-LNvs und DN3s, beginnen, auf Wanderschaft L3-Stadium gebildet werden, aber sie noch nicht unbedingt Radfahren (Daten nicht gezeigt). Daher, obwohl es möglich, Bild ist unbedingt Uhr Neuronen in diesem Stadium (Daten nicht gezeigt) Radfahren, sorgfältig die Larven bereits funktionale Uhr Neuronen unterscheiden Entwicklungsländer für die Datenanalyse. Non-wandering L3 erscheinen ca. 4 bis 4,5 Tage nach Eiablage bei 25 ° C. Um dieses Protokoll verwenden für das Studium der zirkadianen Rhythmen, synchronisieren (verladen) entwickelnden Larven in 12 h/12 h LD Zyklen bei 25 ° C für 3 Tage vor dem L3 Larven sammeln.</li>
		<li>Sezieren Sie Larven Gehirne mit feinen Pinzette im 4. DSS gefüllten Brunnen, die nicht zum Spülen Larven, mit Hilfe der Inside-out-Methode27verwendet wurde.<ol>
<li>Kurz, geschnitten Sie die Larve in zwei Teile, sanft Kneifen Sie die Mund-Haken mit ein paar Zangen und Rollen Sie Inside-out auf-die Körperwand über das andere paar der Zange, damit das Gehirn aussetzen. Kostenlos das Gehirn durch das Ausschneiden der Luftröhre und Nerven, die es mit dem Rest des Körpers zu befestigen.</li>
			<li>Das Gehirn in etwa 3 µL des DSS mit einer 20 µL Pipette (vorher gespült mit DSS) Aspirieren und in der SAM-gefüllte gut verzichten. Wiederholen Sie den Vorgang für bis zu 7 Gehirne. Hinweis: Dissektion sollte durchgeführt werden, auf eine kalte Oberfläche, die Larven betäubt und das Gehirn gekühlt zu halten. Zum Beispiel legen Sie die Dissektion Gericht auf ein Kühlblock, verbunden mit einer Pumpe Eis gekühltes Wasser zirkulieren. Die Dissektion Verfahren dauert ~ 30 s pro Gehirn. Es ist wichtig, die Augen/Riechzentrum imaginalen Scheiben befestigt die Gehirne und die ventrale Nerv Schnur intakt zu halten. Diese Teile abreißen schädigen das Gehirn und verringern die Qualität der Kultur. Vermeiden Sie auch die Gehirne der Luft auszusetzen. Vor der ersten Gehirn, Pipette auf und ab des DSS mit Teilen der sezierten Larven Absaugen verhindert als es die Köpfe an der Wand der Spitze.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Einbettung des Gehirns Explantaten in einer 3D Matrix und Montage (~ 20 min).
	<ol>
<li>Tauchen Sie ein seziert Gehirn in Fibrinogen Arbeitslösung (Fibrinogen Endkonzentration ~3.3 mg/mL, 10,5 µL pro Gehirn) wie folgt:</li>
		<li>Aspirieren Sie 3,5 µL von SAM/Antibiotika (mit der gleichen Spitze verwendet in Abschnitt 3.2.3). Aspirieren Sie seziert Gehirn aus der Dissektion in die gleichen Pipettenspitze ohne Verzicht auf das SAM/Antibiotika-Medium in der Spitze.</li>
		<li>Das Gehirn und das Medium, auf dem Deckel eine sterile Petrischale zu verzichten. Fügen Sie eine weitere 3,5 µL von SAM/Antibiotika und 3,5 µL warm Fibrinogen/SAM 10 mg/mL Lösung auf den Tropfen, die das Gehirn enthält. Mischen Sie die Lösung um das Gehirn durch Pipettieren mit einer Pipettenspitze 20 µL vorsichtig. Hinweis: Mit Hilfe einer Pipette als Zange in diesem Schritt wird vermieden, betonend, dass das Gehirn.</li>
		<li>Nehmen Sie 2 µL der Arbeitslösung Fibrinogen aus dem Drop- und wenden Sie es auf das Deckglas des unteren Glasschale als kleiner Kreis. 0,8 µL von Thrombin und mischen Sie sehr schnell mit einer Pipettenspitze. Das Fibrinogen in Fibrin umgewandelt und beginnt zu polymerisieren.</li>
		<li>Nehmen Sie das Gehirn, das in dem Fibrinogen arbeiten Lösung (Schritt 3.3.1) zwischen einem Paar von Zange sitzt und positionieren Sie es an die Matrix, sobald eine weiße Fibrin-Matrix sichtbar ist. Richten Sie die Gehirn anterioren Seite nach unten (für imaging-Uhr Neuronen). Schieben sie so nah wie möglich an das Deckglas. Fibrin-Gerinnsel besteht aus Schichten von Fibrin. Wählen Sie eine Ebene und Falten Sie es oben auf das Gehirn mit kleinen und sanften Bewegungen ohne Abnehmen der Matrix.<ol>
<li>Wiederholen Sie 2-bis 3-Mal aus verschiedenen Teilen des Gerinnsels, das Gehirn zu stabilisieren. Hinweis: Beim Umgang mit des Gehirns mit der Pinzette seien Sie vorsichtig, nicht zu trocknen oder eine körperliche Belastung zu verhängen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL von SAM/Antibiotika auf das eingebettete Gehirn, um die Aktion von Thrombin zu stoppen.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang um die verbleibenden Gehirne zu montieren. Es ist möglich, bis zu 5 bis 6 Köpfe auf einer Glasschale unten einzubetten.</li>
		<li>Fügen Sie für langfristige live Imaging 600 µL von SAM/Antibiotika im Inneren Brunnen (das Glasteil hinzu). Positionieren Sie eine vorgeschnittene PTFE-Membran auf das Medium zu und kleben Sie es auf das Vakuum Fett auf das Kunststoffteil des Bodens (3.1.5) (Abbildung 1A) angewendet.</li>
		<li>Füllen Sie für pharmakologische Tests die Schale mit 2 mL von SAM/Antibiotika (Abbildung 1 b). Hinweis: Es ist sehr wichtig um Verdunstung des Mediums zu vermeiden, die Osmolalität des Mediums ist kritisch für die Lebensfähigkeit der Neuronen. Daher ist es für langfristige bildgebende Untersuchungen notwendig, der Kulturschale mit PTFE-Membran zu versiegeln. Während für kurzfristige Experimente Abdichtung Membran nicht erforderlich, solange das Gericht ist mit 2 mL Medium gefüllt und in eine feuchte Kammer überwacht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Zeitraffer Bildaufnahme
<ol><li>Legen Sie unten Glasschale auf der Petrischale Inhaber innerhalb der Bühne-Top feuchte Kammer.</li>
	<li>Rufen Sie Z-StackPanel-Element in der Registerkarte "Acquire" und legen Sie die Z-Abschnitt Schritte aus der Mikroskop-Software (2 µm × ~ 40 in den Experimenten, dargestellt in Abbildung 2 und Abbildung 3und Film 1). Beginn des Z-Stapel auf das Flugzeug am weitesten von dem Deckglas und das Ende an der Oberfläche des Gehirns Explant, in der Nähe des Deckglases festgelegt. Obwohl Gehirn Bewegungen sind vernachlässigbar, fügen Sie zusätzliche Z-Profile am Anfang und Ende der Z-Stapel.</li>
	<li>Rufen Sie markieren & Panel und Set-up Multipositionslenker Bildaufnahme zu finden. Mit einem 40 X Objektiv kann 1 Gehirnhälfte innerhalb eines Gesichtsfeldes erfasst werden</li>
	<li>Zum Erwerb Modus Panel und wählen Sie Xyzt (Z-Stack Zeitraffer). Gehen Sie zum Erwerb Panel und die bevorzugte Zeit Intervall und Frequenz-Parameter eingestellt. Hinweis: Erwerben Sie Zeitraffer Bilder mit der gewünschten Frequenz. Beachten Sie, dass langfristige live Bildgebung (24-72 h) mit Zeitraffer Zeitintervall kürzer als 2 h neigt, Ergebnisse in weniger Radsport Neuronen dazu, wahrscheinlich, weil es die Lebensfähigkeit der Neuronen reduziert. Das Datenvolumen wird erweitert, als die Rate der Bild Akquisition erhöht, die Datenanalyse und Lagerung schwieriger macht.</li>
</ol>5. pharmakologische Behandlung des Gehirns Explantaten mit kurzfristigen Live Imaging
Hinweis: Die folgende Prozedur ist im Wesentlichen identisch mit dem für die langfristige Bildgebung aber erfordert keine PTFE-Membran. Um zu vermeiden, setzen die Gehirne um blaues Licht, wenn die Kultur die chemischen hinzugefügt wird, sollte das Mikroskop in den dunklen Raum mit rotem Licht platziert werden.
<ol><li>Gehen Sie zum Erwerb Panel und legen Sie die gewünschte Zeitintervall und die Anzahl der Scan die Baseline-Daten vor der Droge Anwendung zu erhalten. Starten Sie Scan.</li>
	<li>Nach der Baseline Scan abgeschlossen ist, heben Sie die Scan-Kopf des Mikroskop-Systems. Entfernen Sie den Deckel von der Bühne-Top Feuchtigkeitsregler und sehr vorsichtig den Deckel des unteren Glasschale ohne es zu bewegen.</li>
	<li>Entfernen Sie die entsprechende Menge an Kulturmedium, falls notwendig. Die experimentelle Lösung in das Medium hinzufügen und sorgfältig und sehr vorsichtig mit einer sterilen Pasteurpipette ohne Gehirn Explantaten mischen. Hinweis: Für Bad Anwendung der PDF-Datei, verwenden Sie 2 µM PDF-Stammlösung (in 10 % DMSO).</li>
	<li>Ersetzen Sie die Deckel der unteren Glasschale und die feuchte Kammer und die Scan-Kopf. Verwenden, positionieren Sie die schwarze undurchsichtige Tuch um die Mikroskop-Kammer.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die Gehirne auf ihre ursprünglichen Positionen im live-Bild-Modus sind. Passen Sie bei Bedarf.</li>
	<li>Gehen Sie zum Erwerb Panel und legen Sie die gewünschte Zeitintervall und die Anzahl der Scan. Starten Sie Scan. Hinweis: Hier haben wir jede Stunde für bis zu 10 h Zeitraffer Aufnahmen getestet.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier haben wir die Methode zur langfristigen Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie kultivierten Larven Gehirne beschrieben. Der Erfolg dieser Art von Experimenten hängt von mehreren Faktoren ab, wie die Gesundheit der Kultur, Methode zur Immobilisierung des Gehirns Explant, Fluoreszenzintensität und Signal-Rausch-Verhältnis der Reporter, zeitliche und räumliche Auflösung und Zugänglichkeit zu den Explant. Diese Faktoren können sich gegenseitig ausschließen. Zum Beispiel Zeitraffer Häufigkeit beeinflusst die Gesundheit der Ku...

Zirkadiane Uhren helfen Organismen zur Anpassung an die periodischen Veränderungen der Umwelt durch die 24-Stunden-Rotation der Erde erzeugt. Interlock transkriptionelle translationale Rückkopplungsschleifen unterliegen häufig der molekulare Maschinerie der zirkadianen Taktgeber über Arten1. Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung, bestehend aus Uhr-haltigen Neuronen integriert-Uhrzeit-Informationen vermittelt durch die Umwelt-Signale, wie hell/dunkel (LD) und Temperaturzyklen, die Rhythmen von einer Vielzahl von täglich zu orchestrieren physiologischen und Verhaltensstörungen Prozesse2,3. Die Koordinierung der molekularen Rhythmen mit neuronalen ein- und Ausgängen ist von entscheidender Bedeutung für den Betrieb der circadianen Schaltung aber bleibt nur teilweise verstanden.
Das Herzstück der molekularen Uhr aktiviert TAKTZYKLUS (CLK/CYC) Heterodimer in Drosophila, die Transkription von Zeit (pro) und zeitlos (Tim). V. und TIM bilden einen Komplex und geben Sie den Zellkern, wo sie transkriptionelle Aktivität der CLK/CYC und somit ihren eigenen Transkription hemmen. Posttranskriptionale und post-translationalen Vorschriften verursachen Verzögerungen zwischen CLK/CYC-vermittelten Transkription und Unterdrückung durch v. / TIM, Sicherstellung der Generation von ca. 24 h molekulare Schwingungen1,3,4 . Etwa 150 Neuronen, die diese molekulare Uhren-Formular enthält fliegt eine Schaltung zur Kontrolle circadiane Verhalten der Erwachsenen5. Eine viel einfachere und dennoch voll funktionsfähige circadiane Schaltung bestehend aus 3 Gruppen von Neuronen Uhr - 5 ventralen lateralen Neuronen (LNvs; 4 PDF-Positive LNvs und ein PDF-Negative LNv, siehe unten), 2 dorsalen Neuron 1 s (DN1s) und 2 dorsalen Neuron 2 s (DN2s) - ist in der Larven Gehirn6,7.
Die einfache Larven circadiane Schaltung bietet ein hervorragendes Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Inter neuronale Kommunikation und das molekulare Uhrwerk. Mit unserer neu entwickelten fluoreszierende Reporter pro-TDT, die das Niveau der pro Protein und seine subzelluläre Lage imitiert, haben wir versucht, die Dynamik des molekularen Uhrwerks in verschiedenen Uhr Neuron Untergruppen in der Larven circadiane Schaltung charakterisieren 8. Darüber hinaus wollten wir wissen, die Schlüsselrolle von Neuropeptid Pigment dispersing Factor (PDF) produziert von 4 LNvs bei der Regulierung der zirkadianen Rhythmen auf der neuronalen Ebene9,10,11, untersuchen Sie den direkten Wirkung von PDF auf molekularen Uhren. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode, um die circadiane Genexpression überwachen Rhythmen im Larvenstadium Gehirn über mehrere Tage durch Time-Lapse confocal Mikroskopie explant entwickelt. Das Protokoll wurde auch für pharmakologische Tests, testen Sie die Wirkung von PDF- oder andere Verbindungen auf das Niveau der pro-TDT angepasst. Somit besteht die Anpassung der Zugänglichmachung der Gehirn Explant Kultur zu Drug Application, Zeitauflösung und imaging für eine kürzere Dauer.
Ex-Vivo -Kultur von Drosophila Gehirne von unterschiedlichen Entwicklungsstadien wurden vorher festgelegten12,13,14,15,16,17 ,18. Während diese Protokolle für verschiedene biologische Phänomene-Bildgebung verwendet wurden, einige von ihnen sind nicht kompatibel mit Bildgebung bei einzelligen Auflösung oder unterstützen die Kultur nicht mehr als ein paar Stunden. Alternative Methoden, um langfristige live Darstellung der circadianen Neuronen in Drosophila durchzuführen sind Biolumineszenz Bildgebung von molekularen Rhythmen19,20,21 und Fluoreszenz-Bildgebung des Kalzium-Anzeige mit Licht Merkblatt Mikroskopie22,23. Obwohl Biolumineszenz Bildgebung höheren zeitlichen Auflösung erreichen und Lichtblattmikroskopie für in-Vivo Bildgebung anpassungsfähig sein kann, sie sind begrenzt auf die räumliche Auflösung und erfordern spezialisierte Mikroskopsystemen.
Die hier beschriebene Methode ist zugeschnitten auf um fluoreszierende Signale in der Gesamt-Hirn Kultur bei einzelligen Auflösung über mehrere Tage zu visualisieren. Diese einfache und vielseitige Methode könnte Bild kultiviert Erwachsenen fliegen Köpfe und für pharmakologische Experimente zur Untersuchung viele verschiedene Probleme in Drosophila Neurobiologie angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>Ich bin mir nicht sicher, ob es genau die gleichen sind, die wir im Labor haben. Wann immer verfügbar, habe ich "geeignet für Insektenzellkultur" gewählt</td></tr>: <tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich,</td><td>C7902</td><td></td></tr>, <tr><td>MgSO4.7H2O,</td><td>Sigma-Aldrich</td>, <td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>S5886</td><td></td></tr>, <tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich,</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&minus;)-Apfelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Bernsteinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>Fumarsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Ketoglutarsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>Nicht hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum (FCS) Durch Mykoplasmen und Viren gescreent</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, PH 7,4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen aus Rinderplasma</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>ACHTUNG: Gesundheitsschädlich durch Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Manipulieren Sie unter laminarer Strömung</td></tr><tr><td>Thrombin aus Rinderplasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>ACHTUNG: Gesundheitsgefahr, Handschuhe verwenden</td></tr><tr><td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>maßgeschneidertes</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfett</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 20 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Gewebekulturschalen</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Steriler 500 mL Steritop-GP 33 mm Flaschenaufsatzfilter mit Gewinde, 0,22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluorethylen (PTFE)-Folie</td><td>Dupont</td><td>200A Teflon-FEP-Folie</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45&nbsp; &Mikro; m, PVDF, 33&nbsp; mm, gammasterilisiert</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Spritzenfiltereinheit, 0,22&nbsp; &Mikro; m, PVDF, 33&nbsp; mm, gammasterilisiert</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Drei-Well-Dissektionsschale aus Glas</td><td>Beliebig Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette, Größe 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tandem-Scanner inverses konfokales Mikroskop TCS SP5, mit Resonanzscanner und HyD-Photomultiplier-Detektoren</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperierkammer</td><td>Life Imaging Services</td><td>Der CUBE & BOX-Temperaturregelungssystem, kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>Stage-Top-Feuchteregler</td><td>Life Imaging Services</td><td>kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>Wasserimmersions-Mikrodispenser: Dispenser, erweiterte Mikropumpe MP6-Serie und Autoimmersion Objective Controller Software</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUM-Stack-Erstellung und 3D-Korrekturdrift-Plugin</td><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x iterative Dekonvolution</td><td>AutoQuant und Imaris Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einzellige auflösung fluoreszenz imaging von drosophila zirkadiane uhren in larven gehirn kultur leben

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung orchestriert rhythmische Verhaltens- und physiologischen Ausgänge mit ökologischen Hinweise, wie Tag/Nacht-Zyklen abgestimmt. Die molekulare Uhr innerhalb jedes Neuron Herzschrittmacher erzeugt zirkadianen Rhythmen in der Genexpression, die die rhythmischen neuronalen Funktionen wesentlich für den Betrieb der Schaltung zugrunde liegen. Untersuchung der Eigenschaften der einzelnen molekulare Oszillatoren in verschiedenen Unterklassen der Herzschrittmacher Neuronen und deren Zusammenspiel mit neuronalen Signal ergibt ein besseres Verständnis der zirkadianen Schrittmacher-Schaltung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie-Ansatz entwickelt, um die molekularen Uhrwerk in Uhr Neuronen des kultivierten Drosophila Larven Gehirn zu überwachen. Diese Methode ermöglicht die mehrtägige Aufzeichnung von den Rhythmen der genetisch codierten fluoreszierende circadiane Reporter bei einzelligen Auflösung. Dieses Setup ist kombinierbar mit pharmakologische Manipulationen zu Echtzeit-Reaktion der molekularen Uhr zu verschiedenen Verbindungen genau analysieren. Über zirkadianen Rhythmen bietet diese multifunktionale Methode in Kombination mit leistungsstarken Drosophila genetische Techniken die Möglichkeit verschiedene neuronale oder molekulare Prozesse in live Hirngewebe zu studieren.

Hier zeigen wir die repräsentativen Ergebnisse der langfristigen Aufnahme eines circadianen fluoreszierende Reporter in ex Vivo Larven Gehirn Kultur und bildgebenden Liveergebnisse PDF Bad Anwendung auf Reporter Ausdruck.
Non-wandering L3-Larven Ausdruck der molekularen Uhr Reporter pro-TDT und FH-mCD8::YFP, angetrieben von einem Uhr-Neuron-Fahrer Clk 856-gal4 (Abbildung 1) wurden ...

Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Gehirne von Drosophila-Larven für die mehrtägige Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zu kultivieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Drosophila-Neurogenetik zu beantworten, wie z.B. Veränderungen der Genexpression, die in bestimmten neuronalen Populationen auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Bildgebung von Fluoreszenzsonden mit Einzelzellauflösung im lebenden Gehirn über einen Zeitraum von Stunden bis Tagen ermöglicht.Arbeiten Sie bei der Vorbereitung der Reagenzien für dieses Verfahren unter einer Kulturhaube. Sowohl ein Aliquot des SAM-Mediums als auch des Thrombins muss aufgetaut werden, um zu beginnen. Das Thrombin beiseite stellen.Nehmen Sie ein Aliquot von 2,5 Millilitern SAM, legen Sie das restliche SAM auf Eis und legen Sie es beiseite. Geben Sie dann Penicillin-Streptomycin in das aliquotierte SAM und halten Sie es bei Raumtemperatur. Bereiten Sie für Langzeit-Bildgebungsexperimente eine Vorstellungskammer vor und tragen Sie autoklaviertes Vakuumfett auf die Kunststoffbereiche um die Vertiefung einer Glasbodenschale auf.Anschließend die gefettete Form mit UV-Licht unter der Haube sterilisieren. Mischen Sie nun ein Aliquot SAM in das Fibrinogen und überführen Sie das Gemisch auf 37 Grad Celsius, wo es zwei Stunden lang nicht polymerisiert. Für die Dissektion reinigen Sie die Pinzette in zwei Dissektionsschalen aus Glas mit drei Vertiefungen mit 70 % Ethanol.Beladen Sie dann vier Vertiefungen mit 400 Mikrolitern DSS und eine Vertiefung mit 400 Mikrolitern SAM. Bewahren Sie die Sezierschalen auf einem gekühlten Teller auf. Schöpfen Sie aus einem Fläschchen mit sich vermehrenden Fliegen etwas Medium mit nicht wandernden Larven des dritten Stadiums aus und geben Sie bis zu sieben mit einer Pinzette in eine Vertiefung mit kaltem DSS.Führen Sie dann die Larven durch drei der vier mit DSS beladenen Vertiefungen, um sie zu reinigen, und lassen Sie sie in der letzten Vertiefung, bis sie präpariert sind. Verwenden Sie die vierte Vertiefung von DSS, um die Larvengehirne mit einer sauberen, feinen Pinzette zu sezieren.Verwenden Sie die bewährte Inside-Out-Methode. Mit Geschick kann jede Larve in etwa 30 Sekunden verarbeitet werden. Verwenden Sie nach jeder Dissektion eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze, die mit DSS vorgespült wurde, um das Gehirn in etwa drei Mikrolitern DSS in die mit SAM gefüllte Vertiefung zu übertragen.Bereiten Sie bis zu sieben Gehirne auf das Einbettungsverfahren vor. Nachdem Sie das Gehirn in die Arbeitslösung überführt haben, geben Sie das Gehirn und das Medium auf den Deckel einer sterilen Petrischale. Fügen Sie dann weitere 3,5 Mikroliter SAM mit Antibiotika hinzu und fügen Sie 3,5 Mikroliter warmes SAM mit Fibrinogen hinzu.Es ist wichtig, das SAM-Medium während des gesamten Eingriffs mit Fibrinogen auf 37 Grad zu halten. Mischen Sie als Nächstes die Lösung um das Gehirn herum, indem Sie vorsichtig mit derselben Pipettenspitze pipettieren und aspirieren Sie zwei Mikroliter der Lösung, um sie auf einem Deckglas für eine Glasbodenschale abzulagern. Fügen Sie dann 0,8 Mikroliter Thrombin zum Tröpfchen hinzu und mischen Sie sehr schnell, um die Polymerisation zu initialisieren, die weiß erscheint.Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Gehirn vorsichtig zu berühren und es auf die polymerisierende Fibrinmatrix zu setzen. Ich denke, das Thrombin, nachdem das Gehirn auf das Tröpfchen übertragen wurde, wird nicht empfohlen, da es einen Großteil des Verfahrens erschwert. Richten Sie das Gehirn nach Bedarf aus und schieben Sie das Gehirn ganz vorsichtig so nah wie möglich an das Deckglas.Nehmen Sie dann eine Schicht polymerisiertes Fibrin und falten Sie sie mit kleinen und sanften Bewegungen, die sich nicht von der Matrix lösen, auf das Gehirn. Falten Sie weiterhin Schichten von polymerisiertem Fibrin aus verschiedenen Teilen des Gerinnsels über das Gehirn, um das Gehirn zu stabilisieren. Lagern Sie dann 20 Mikroliter SAM mit Antibiotika über dem eingebetteten Gehirn ab, um die Thrombinaktivität zu stoppen.Mit diesem Verfahren fahren Sie fort, indem Sie fünf bis sechs Gehirne auf eine Glasbodenschale einbetten. Für die Langzeitbildgebung tauchen Sie die eingebetteten Gehirne in 600 Mikroliter SAM mit Antibiotika. Legen Sie dann ein Stück PTFE-Membran über das Medium und kleben Sie die Ränder der Membran auf die gefetteten Teile der Schale.Füllen Sie für kurze Assays die Schale mit zwei Millilitern SAM mit Antibiotika, tauchen Sie das Gehirn ein und verzichten Sie auf die Verwendung der PTFE-Membran. Mit den beschriebenen Verfahren wurden Gehirne, die einen molekularen Uhrreporter exprimieren, der von einem Uhrenneuronentreiber gesteuert wird, in Hell-Dunkel-Phase mitgerissen und dann als Explantatkulturen präpariert. Die Langzeitkulturen wurden während der hellen Phase, kurz vor Einbruch der Dunkelheit, aufgebaut.Es wurde ein SUMMEN-Stack erstellt, der das interessierende Neuron in der mittleren Fluoreszenzintensität des Bereichs enthält, der dem Neuron entspricht, das nach der Hintergrundsubtraktion gemessen wurde. Um die Rhythmizität der Reporterexpression zu bestimmen, wurden sowohl die Spektralanalyse der maximalen Entropie als auch die manuelle Inspektion verwendet. Als nächstes wurden Larven des gleichen Genotyps entweder eine Stunde nach der subjektiven Morgendämmerung oder eine Stunde nach der subjektiven Abenddämmerung seziert.Die Gehirne wurden innerhalb einer Stunde zweimal abgebildet, um eine Ausgangsbasis zu erhalten. Dann wurde das Kulturmedium mit einer PDF-Datei oder einem Vehikel versehen und die Gehirne wurden sechs Stunden lang stündlich abgebildet. In Gehirnen, die kurz nach Einbruch der Dunkelheit entnommen wurden, zeigte das PER-TDT-Expressionsprofil in LNvs einen tageszeitabhängigen Anstieg der Fluoreszenzintensität nach PDF-Addition.Dies geschah auch bei den DN1 und in geringerem Maße bei den DN2. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ex-vivo-Gehirnkulturen aus Drosophila-Larven mit einer 3D-Matrix aus Fibrin herstellt. Einmal gemeistert, dauert das gesamte Verfahren etwa 30 Minuten, von der Präparierung bis zum Einbetten.Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, bereiten Sie die Bildgebung vor, damit das Gehirn sofort nach der Einbettung abgebildet werden kann. Nach diesem Verfahren können auch adulte Drosophila-Gehirne für die Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung kultiviert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

Source: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Fluoreszenz-Live-Bildgebung mit Einzelzellauflösung von Drosophila Zirkadiane Uhren in der Larven-Gehirnkultur. &lt;span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;(2018). Dieses Video zeigt das Verfahren zum Einbetten der Drosophila Gehirn in einer Fibrinmatrix, gefolgt von einer...

Einbettung des Drosophila-Gehirns in eine Matrix für die Zeitraffer-Bildgebung der Neuronen der zirkadianen Uhr

Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Hier beschreiben wir die Methode, die wir angewendet haben, um hochmotile dendritische Filopodia in einer Live-Vorbereitung des Drosophila-Larvenhirns abzubilden, und das Protokoll, das wir entwickelt haben, um Zeitraffer-3D-Bildgebungsdatensätze für quantitative Bewertungen von Dendriten zu quantifizieren. Dynamik bei der Entwicklung von Neuronen.

Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen

Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Live-Bildgebung der asymmetrischen Teilung von Keimbahnstammzellen (GSCs) in der ovariellen Nische von Drosophila durchzuführen. Wir verwenden eine transgene Linie, die ubiquitär eine grün fluoreszierende Protein (GFP)-Fusion des Spektrosomproteins Par-1 exprimiert.

Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen

Erfahren Sie die Einzelzell-Fluoreszenzabbildung zirkadianer Uhren in Drosophila-Larvengehirnen. Diese Methode ermöglicht die Langzeitbeobachtung molekularer Rhythmen in spezifischen Neuronenpopulationen.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

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