Isolement de cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain pour des études phénotypiques et fonctionnelles

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules dendritiques de différents compartiments anatomiques de l’appareil reproducteur féminin humain afin d’évaluer leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les cellules dendritiques résidentes dans les tissus de l’appareil génital féminin, telles que la compartimentation anatomique de sous-ensembles spécifiques et leurs caractéristiques fonctionnelles. Le principal avantage de cette technique est que notre protocole de digestion tissulaire ne clive pas les marqueurs de surface, ce qui permet d’isoler immédiatement les cellules dendritiques sans incubation pendant la nuit ni activation cellulaire.

Bien que cette méthode ait été optimisée pour isoler les cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain, elle peut également être adaptée pour isoler d’autres cellules immunitaires ou cellules dendritiques d’autres tissus. Fiona Barr et Jared Fortier, techniciens de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez cette procédure en rinçant le tissu avec du HBSS modifié.

Placez le mouchoir dans une boîte de Pétri de 100 x 15 millimètres carrés et ajoutez environ trois millilitres d’un cocktail d’enzymes de digestion pour éviter que le tissu ne se dessèche. Tout en utilisant une pince pour stabiliser le tissu, hachez-le avec un scalpel pour augmenter la surface du tissu exposé au cocktail d’enzymes de digestion. Coupez le tissu en petits morceaux.

Ajoutez suffisamment de cocktail d’enzymes de digestion pour couvrir tous les morceaux de tissu et placez le couvercle sur la boîte de Pétri. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone sur un rotateur à environ 80 tr/min pendant 45 minutes. Assurez-vous que la vitesse du rotateur mélange bien le cocktail d’enzymes de digestion sans renverser ni produire de bulles.

Après 45 minutes, visualisez la préparation des tissus avec un microscope à lumière inversée avec les objectifs 4X et 10X. Une digestion enzymatique réussie devrait libérer des feuillets épithéliales et des glandes, comme le montre cette image représentative. Effectuer la séparation de cellules individuelles dans un environnement stérile.

Tout d’abord, placez une maille tendue de 250 micromètres avec support dans une boîte de Pétri de 150 x 15 millimètres carrés et assurez-vous que la maille est à environ 0,5 centimètre au-dessus de la surface de la boîte de Pétri. Ensuite, mouillez le treillis avec deux millilitres de HBSS modifié et transférez le tissu digéré sur le treillis. À l’aide de la surface plane d’un piston de seringue de 10 millilitres, broyez doucement mais fermement le tissu haché digéré à travers le filet.

Une fois que les fragments de tissu ont été complètement dispersés, élevez le treillis et le support de deux à trois centimètres au-dessus de la boîte de Pétri, et rincez avec trois millilitres de HBSS modifié pour récupérer des cellules supplémentaires. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Placez un maillage de 20 micromètres avec un support à environ deux à trois centimètres au-dessus d’une nouvelle boîte de Pétri, et mouillez-le avec deux millilitres de HBSS modifié.

Faites passer la suspension cellulaire à travers le maillage et rincez avec six millilitres de HBSS modifié. Prélever la suspension à cellules mixtes et centrifuger à 500 fois g pendant 10 minutes. Aspirez le liquide et remettez le granulé en suspension dans quatre millilitres de HBSS modifié.

Superposez la suspension à cellules mixtes sur trois millilitres de solution de polysaccharose pour la centrifugation par gradient de densité. Centrifugeuse à température ambiante à 500 fois g pendant 30 minutes sans frein. Prélevez la bande blanche sur le dessus de la solution de polysaccharose et lavez-la avec du PBS.

Une fois la suspension de cellules mixtes enrichie recueillie, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre au microscope optique avec l’objectif 10X. Faites tourner toutes les cellules de la suspension cellulaire pendant 10 minutes. Aspirez complètement et jetez le surnageant.

Ensuite, ajoutez des billes d’élimination des cellules mortes et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, placez un filtre de 30 micromètres sur le dessus de la colonne pour retenir les débris tissulaires ou les agrégats cellulaires restants. Rincez le filtre et la colonne avec un tampon d’élimination des cellules mortes.

Ensuite, appliquez la suspension cellulaire et laissez les cellules marquées par des billes s’écouler à travers la colonne magnétique. Rincez la colonne avec trois millilitres de tampon d’élimination des cellules mortes quatre fois. Récupérez le flux contenant les cellules vivantes.

Après l’élimination des cellules mortes, faites tourner les cellules vers le bas. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de sélection magnétique, 80 microlitres de tampon par un fois 10 aux sept cellules. Pour une sélection positive des populations de cellules dendritiques, ajoutez des billes magnétiques CD1a ou CD14 et incubez à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Lavez les cellules avec le tampon de sélection magnétique, faites-les tourner, retirez complètement le tampon et remettez les cellules en suspension dans un minimum de 500 microlitres de tampon de sélection magnétique. Fixez la colonne à l’aimant et ajoutez un filtre de 30 micromètres sur le dessus de la colonne pour retenir les débris tissulaires ou les agrégats cellulaires restants. Rincez le filtre et la colonne avec un tampon de sélection magnétique.

Appliquez la suspension de cellule à la colonne. Rincez trois fois avec trois millilitres de tampon de sélection magnétique. Transférez la colonne dans un tube de 15 millilitres.

Ajoutez cinq millilitres de tampon de sélection magnétique et appliquez le piston pour libérer les cellules sélectionnées de la colonne. Pour augmenter la pureté, répétez les étapes de purification avec les cellules récupérées à l’aide d’une nouvelle colonne. Par la suite, évaluer la pureté cellulaire par cytométrie en flux et microscopie, comme décrit dans le protocole textuel.

Avant de commencer ce test, les lymphocytes T naïfs sont isolés des cellules mononucléées du sang périphérique à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Lavez les cellules T naïves deux fois avec du PBS. Remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS.

Le reste du protocole est effectué dans l’obscurité. Tout en faisant doucement tourbillonner les cellules dans l’enceinte de biosécurité, ajoutez 500 microlitres d’une solution 2X de colorant de prolifération cellulaire aux cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Arrêtez le marquage cellulaire en ajoutant aux cellules cinq millilitres de milieu de culture cellulaire avec 10 % de sérum AB humain. Incuber sur glace pendant cinq minutes, à l’abri de la lumière. Centrifugez les cellules à environ 500 fois g pendant sept minutes.

Aspirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu de culture cellulaire avec 10 % de sérum AB humain. Avant la dernière centrifugation, prélever une aliquote de cellules pour les compter. Après le troisième lavage, remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture cellulaire avec 10 % de sérum AB humain à la concentration cellulaire souhaitée.

Pour commencer la co-culture allogénique de cellules T naïves de cellules dendritiques, plaquez les cellules dendritiques isolées et les cellules T naïves dans une plaque à fond rond de 96 puits avec un rapport de 1 à 15 entre les cellules dendritiques et les cellules T. Centrifugez la plaque à environ 500 fois g pendant trois minutes pour vous assurer que les cellules sont situées au centre du puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant six jours.

Surveiller les cellules par microscopie. Après six jours, évaluer la prolifération cellulaire par cytométrie en flux, comme décrit dans le protocole textuel. Ce graphique montre la plage du nombre total de cellules viables récupérées après le traitement des tissus et l’élimination des cellules mortes dans chaque compartiment de l’appareil reproducteur féminin, l’endomètre, l’endocol et l’ectocol.

Le nombre de cellules dendritiques viables récupérées par gramme de tissu après isolement des billes magnétiques est indiqué ci-dessous. La morphologie dendritique des cellules isolées a été déterminée par microscopie après coloration à Giemsa. L’expression des marqueurs phénotypiques avant et après l’isolement des billes a été déterminée par cytométrie en flux.

Après l’isolement des billes CD1a positives et CD14 positives, la pureté variait entre 85 et 92 %. La formation d’amas de cellules T au cours de la prolifération a été confirmée par coloration à la prolifération des colorants. La prolifération a ensuite été quantifiée par cytométrie en flux.

La stratégie de déclenchement pour identifier différentes cellules dendritiques dans la suspension de cellules mixtes est illustrée. Chaque population fermée dans des graphiques multicolores est affichée dans le panneau suivant. À la suite de la stratégie de contrôle, des sous-ensembles spécifiques de cellules dendritiques sont identifiés.

Un faible nombre de cellules est attendu, car les cellules dendritiques tissulaires sont des populations rares. Une fois maîtrisé, l’isolement des cellules dendritiques des tissus peut être effectué en quatre à cinq heures s’il est effectué correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de digérer et de traiter enzymatiquement les tissus pour générer une suspension de cellules mixtes unique et effectuer une sélection de billes magnétiques de cellules dendritiques pour une caractérisation plus approfondie.