Name: 지역화를 Autometallography 및 Cetacean 조직에 실버 반 계량의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 학습하세요 오토메탈로그래피를 이용한 고래류 간과 신장 조직 내 은 정량화 방법을. CHAA 분석법으로 중금속 독성 연구에 활용할 수 있는 경제적이고 신뢰성 높은 환경독성학 기술을 습득하세요.

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우리는 대만 Cetacean 좌초 네트워크 샘플 수집 및 저장, 대만 Cetacean 사회, 타이페이;를 포함 하 여에 대 한 감사 Cetacean 연구 실험실 (교수 선취 Siang Chou), 연구소의 생태학 및 진화 생물학, 국립 대만 대학, 타이 페이; 자연 과학 (박사 Chiou-주 야 오), 타이중;의 국립 박물관 그리고 해양 생물학 & Cetacean 연구 센터, 국립 쳉 쿵 대학. 우리 또한 그들의 허용에 대 한 임업 국, 농업 위원회, 행정원을 감사합니다.

연구 국제 지침에 따라 수행 하 고 cetacean 조직 샘플의 사용은 위원회의 농업의 대만 (연구 허용 104-07.1-SB-62)에 의해 허용 되었다.
1. 조직 샘플 준비 ICP MS 분석
참고: 간, 신장 조직 수집에서 갓 죽은 고 적당히 autolyzed 좌초 고래24, 4 종, 1 그램퍼스 griseus (Gg), 6 좌초 된 고래를 포함 하 여 2 Kogia 종 (코), 2 Lagenodelphis 호세이 (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). 좌초 각 cetacean 개별 식별 필드 번호를 했다. ICP MS 분석용 조직 샘플 준비 따라 수소 첸의 연구소를 설립 하는 방법 그리고 수소 첸의 연구소 ICP MS 분석11,,1325실시.
<ol><li>좌초 고래에서 간 및 신장 조직 ICP MS 분석에 대 한 수집 하 고 사용까지 그들을 −20 ° C에 저장.</li>
	<li>일치 하는 쌍 간 수집 하 고 동일한에서 신장 조직 AMG 분석을 위한 고래 좌초 (2 단계 참조).</li>
	<li>스테인리스 스틸 메스와 ICP MS 분석을 위해 수집 된 조직 샘플의 바깥 레이어를 정돈 한다. 작은 조각 (약 1 c m3)으로 조직 샘플의 안쪽 부분을 잘라내어 지퍼 잠금 비닐 봉투에 넣어. 일반적으로, 각 가방에는 조직의 10 g 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>후속 절차에 대 한 −20 ° C에서 조직 샘플을 포함 하는 비닐 봉지를 저장 합니다.</li>
	<li>상수 무게에 의해 완전히 건조 1 cm3 큐브 샘플 동결 건조 시스템 (-50 ° C, 적어도 98 L/min, 0.002 mBar의 변위와 진공 펌프)까지 적어도 72 h에 넣어.</li>
	<li>이후 조직 소화 균질 화기와 분말으로 건조 큐브를 균질.</li>
	<li>30 mL 소계 (PTFE) 병에 무 균 동결 샘플 0.3 g의 무게와 65 %w / w 질소 산의 10 mL와 함께 그들을 섞는다.</li>
	<li>PTFE 병에 클로저를 넣어 하지만 untightened 폐쇄를 두고. 참고:이 수 수 PTFE 병과 역류 성 식도 염에서 형성 하는 갈색 연기 소화에 대 한 병 안에 갈색 연기 사라진다 고 분명 때까지.</li>
	<li>PTFE 병에 갈색 가스 무색와 된다 PTFE 병에서 액체 반투명 초 때까지 2 ~ 3 주 위해 PTFE 병에서 (갈색 연기 조건 형성)에 따라 110/120 ° C에 30 ° C에서 핫 플레이트로 소화 샘플 열 노란색 또는 완전히 취소에 창백을 nish 참고: 화학 증기 두건에서 난방 과정을 수행 합니다.</li>
	<li>0.5-1까지 PTFE 병에 질 산 증발을 120 ° C에서 소화 샘플 열 mL 남아. 참고: 화학 증기 두건에서 난방 과정을 수행 하 고 항상 갈색 가스 PTFE 병 폐쇄에서 누수 확인을 증가 하는 온도 모니터링 합니다.</li>
	<li>폐쇄를 강화 하 고 약 1 시간에 대 한 실내 온도에 냉각.</li>
	<li>장소 필터와 퍼 널 논문 25 mL 부피 플라스 크에 씻어 25 mL의 최종 볼륨을 1 M HNO3 남은 액체. 참고: 두 번 이상 세 번 및 폐쇄 병 세척.</li>
	<li>얼 뜨기-2 (dogﬁsh 간) 및 기숙사-2 (dogﬁsh 근육)을 포함 하 여 표준 참고 자료를 사용 하 여 ICP MS 분석의 분석 품질을 확인 합니다.</li>
	<li>각 분석 샘플의 중복 및 ICP MS 분석을 위한 표준 참고 자료의 triplicates를 사용 합니다.</li>
	<li>각 분석 샘플의 Ag 농도 평균 하 고 건조 중량 기준 농도 (μ g/g 건조 중량)으로 데이터를 제시.</li>
</ol>2. 조직 AMG 분석을 위한 시료 준비
<ol><li>AMG 분석에 대 한 일치 하는 쌍의 간 및 신장 조직 좌초 cetacean에서 수집 하 고 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 사용까지 그들을 수정. 참고: 24 ~ 48 시간 동안 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF, pH 7.0)에 플라스틱 병에서 조직 샘플을 저장 합니다. NBF의 볼륨은 적어도 10 배 이상의 조직 볼륨 이어야 한다.</li>
	<li>포 르 말린 고정 간 및 신장 조직 스테인리스 일회용 톰 블레이드와 함께 트림 하 고 트림된 조직 섹션 레이블 카세트에 넣어. 참고: 각 조직 단면도의 크기 대략 2 cm x 1 cm 고 각 조직 단면도의 두께 넘지 말아야 한다 3 m m. 간 및 신장 조직 같은 카세트에 동일한 개인에서에 넣어.</li>
	<li>탈수는 트림 조직 섹션 등급된 에탄올 (1 시간에 70%, 1 시간에 80%, 1 시간에 대 한 95%, 2 시간에 대 한 95%, 요리, 얼룩이 1 h x 2에 대 한 100% 및 2 h에 대 한 100%)의 시리즈를 통해 조직 프로세서 (1 h 및 다른 얼룩 요리에서 2 h)에 대 한 비-크 실 렌 (1 h 및 다른 얼룩 요리에서 2 h)에 대 한 parafﬁn에서 탈수 조직 샘플을 젖어.</li>
	<li>강철 조직학 금형의 바닥에서 탈수 조직 샘플을 놓고 파라핀과 탈수 조직 샘플을 포함 합니다.</li>
	<li>포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 블록 찬 격판덮개에는 파라핀 굳은 때까지 침착 해. 조직 표면 노출 될 때까지 톰와 FFPE 블록을 잘라.</li>
	<li>톰에 의해 −20 ° C 10 분 섹션 5 µ m에서 FFPE 블록 FFPE 블록을 진정.</li>
	<li>45 ° c.에 이중 증 류 물으로 물을 욕조를 작성 조직 단면도의 리본 들어올리고 족집게와 브러쉬를 사용 하 여 따뜻한 물 표면에 떠 있도록 합니다.</li>
	<li>핀셋으로 조직 단면도의 리본을 구분 합니다. 현미경 슬라이드에 섹션을 배치 합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드 슬라이드에 따뜻한 고 37 ° c.에 건조 하룻밤 섹션 허용</li>
	<li>현미경 슬라이드를 슬라이드 선반에 넣고 순수 비-크 실 렌 (약 200 ~ 250 mL) 8, 5, 및 3 분의 3 다른 얼룩 요리에서 그들을 몸을 담글 하 여 그들을 deparaffinize.</li>
	<li>슬라이드 선반에서 조직 섹션 등급된 에탄올 솔루션 (100% 에탄올 두 번, 한 번 90% 에탄올 및 80% 에탄올 한번 [각 1 분])의 다른 얼룩 요리에서 그들을 몸을 담글 하 여 수 화 그리고 이중 증 류 물에서 그들을 씻어. 참고:이 솔루션은 다른 얼룩 요리에 약 200 ~ 250 mL. 각 씻어 30 초입니다.</li>
	<li>조직 섹션 인산 버퍼 (PBS) 염 0.5%에서 트라이 톤 X-100, 세척 그들에 PBS를 가진 시간, 그리고 이중 증 류 물에서 그들을 씻어 다음으로 하는 린스 참고:이 솔루션은 다른 얼룩 요리에 약 200 ~ 250 mL. 각은 30 초 정도입니다.</li>
	<li>어두운에서 은색 향상 키트에 의해 제공 세 가지 구성 요소 (초기자, 운영자, 및 활성 제)의 동일 금액을 준비 하 고 철저 하 게 그들을 믹스. 참고: 운영자 및 활성 솔루션 스티커, 사용 하시기 바랍니다 넓은 팁 채용과 플라스틱 (또는 넓은 구멍을 만드는 팁). 각 슬라이드에 대 한 (조직 섹션의 크기)에 따라서 혼합된 솔루션의 300 μ는 충분히 일반적으로. 따라서, 10 슬라이드를 사용 하는 경우 각 구성 요소 (초기자, 운영자, 및 활성 제)의 금액은 1000 μ (혼합된 솔루션은 10 슬라이드에 대 한 3000 μ).</li>
	<li>실 온에서 어둠 속에서 15 분 동안 혼합 솔루션에서 조직 단면도 품 어. 완전히 혼합 솔루션 슬라이드에 조직 단면도 커버. 장시간 보육 긍정 AMG 신호 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>슬라이드 이중 증 류 물으로 세척 하 고 10 hematoxylin에 얼룩으로 counterstain s.</li>
	<li>수돗물을 실행 하 고 슬라이드를 세척 하 고 건조, 설치 매체와 함께 탑재.</li>
	<li>가벼운 현미경 슬라이드를 검사 합니다.</li>
	<li>무작위로 컴퓨터 이미징 소프트웨어와 연결 된 디지털 카메라를 사용 하 여 각 조직 섹션에서 40 X 객관적 렌즈 10 조직학 이미지를 캡처하십시오.</li>
</ol>3. 반 정량적 분석 조직학 이미지의 AMG 양수 값에 대 한
참고: AMG 양수 값의 AMG 긍정적인 신호 영역 비율을 의미합니다.
<ol><li>이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)를 사용 하 여 조직학 이미지 분석.</li>
	<li>파일을 눌러 조직학 이미지를 엽니다 | 오픈.</li>
	<li>이미지를 눌러 선택한 그림 3 색 채널 (빨강, 파랑 및 녹색)으로 분할 | 유형 | RGB 스택.
</li>
	<li>파랑 채널을 사용 하 여 AMG 긍정적인 신호를 계량. 핵 거짓 긍정적인 신호는 핵 counterstain (그림 2)에 대 한 적용 되며 얼룩 파랑 채널 아래 일반적으로 감소 됩니다.</li>
	<li>임계값 도구로 각 조직학 이미지에 AMG 긍정적인 신호 영역 비율 측정 (이미지 | 조정 | 임계값).</li>
	<li>수동으로 (90 ~ 110)에서 조직학 각 이미지에 대 한 임계값의 컷오프 값 거짓 긍정적인 지역 핵 또는 적혈구의 존재에 따라 조정 합니다. 참고: 기본 설정, AMG 긍정적인 신호는 빨간색으로 강조 한다.</li>
	<li>보도 분석 | 설정 측정, 및 지역 일부 지역 분수 기록 됩니다 지정 하려면 확인란을.</li>
	<li>보도 분석 | 측정. 조직학 각 이미지의 긍정적인 비율 영역 % 영역 결과 창의 열에 표시 됩니다.</li>
	<li>각 조직 섹션에서 10 조직학 이미지의 긍정적인 비율 지역 평균 고 각 조직 섹션 AMG 양수 값으로 결과 정의 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig2.jpg"> 그림 2: 다른 색상 채널에서 거짓 긍정적인 신호를 핵의 존재 (counterstain: hematoxylin 얼룩). 대표적인 핵 거짓 긍정적인 신호는 노란 화살표로 표시 됩니다. PPA 영역의 긍정적인 비율 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
4. Cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설) 회귀 모델에 의해 설립
참고: 다음과 같은 분석은 Windows 용 프리즘 6.01에서 수행 됩니다.
<ol><li>ICP-MS의 결과 AMG 양수 값 사이의 상관 관계를 평가 합니다.</li>
	<li>소프트웨어를 열고 새 프로젝트 파일을 만들고 XY 를 선택 하 고 상관.
</li>
	<li>ICP-MS와 AMG 양수 값의 결과 포함 하 여 입력된 데이터입니다.</li>
	<li>분석 을 눌러 고 피어슨 상관 분석에 의해 ICP-MS의 결과 AMG 양수 사이 협회의 강도 분석을 XY 분석 범주 상관 관계 를 선택 합니다. 참고: ICP-MS와 AMG 양수의 결과;와 긍정적으로 상관 될 필요가 그렇지 않으면, 후속 회귀 모델 개발 안 한다.</li>
	<li>선형 회귀, 이차 회귀, 입방 회귀 및 기원, 통계 소프트웨어12,,2627통해 통해 선형 회귀를 포함 한 회귀 모델을 비교 하 여 통계적으로. 참고: 회귀 모델에서 비현실적인 Ag 농도, 회귀 모델 버려진된12되어야 한다.</li>
	<li>데이터 테이블 (왼쪽된 패널)에 다시가 서 누르고 분석 | XY 분석 범주 비선형 회귀 (곡선 적합) | 확인합니다.</li>
	<li>창에서 매개 변수: 비선형 회귀, 페이지 맞춤 에서 다른 회귀 모델을 선택 하 고 다음 비교페이지에서 다른 회귀 모델을 비교.</li>
	<li>비교페이지에서 여분의 합계의 사각 F 테스트 및 아카이 케의 정보 기준 (AIC) 포함 하는 비교 방법을 선택 합니다. 비교 방법의 결과 욕설에 상대적으로 적절 한 회귀 모델을 사용 합니다.</li>
	<li>욕설을 사용 하 여 알 수 없는 Ag 농도와 cetacean 간 및 신장 조직의 Ag 농도 견적 한다.</li>
	<li>정확성과 간 및 신장 조직에 대 한 욕설의 정밀도 평가 합니다. 정밀도 정확도 차이점은 그림 3에 나와 있습니다.</li>
	<li>정확도: 알려진 및 예상 Ag 농도 차이에서 평균 표준 편차 (SD)를 계산 합니다.</li>
	<li>정밀도: 동일한 FFPE 직물에서 직렬 섹션의 AMG 양수 값의 (적어도 triplicate) 반복된 측정을 수행 합니다. 알려진 및 예상 Ag 농도 사이의 차이에서 간 또는 신장 조직에서 측정의 SD 평균 계산 참고: 정확도 및 정밀도 평가의 방법은 그림 4에 묘사 된다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig3.jpg"> 그림 3: 정확도 및 정밀도 차이. 정확도 의미 얼마나 가까운 측정 하는 것입니다 진정한 가치 (즉, Ag 농도 ICP MS에 의해 결정); 정밀 (즉, triplicate 조직 섹션에서 AMG 양수 값의 반복된 측정 간의 일관성) 측정의 반복성을 의미합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig4.jpg"> 그림 4: 정확성과 정밀도 평가의 방법을 묘사 계획. CHAA = cetacean 조직학 Ag 분석 결과; FFPE = 포 르 말린 고정 파라핀 포함; ICP MS = 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학; Ai 각 ICP-MS 각 쌍 일치 조직 샘플;의 의해 결정 Ag 농도 = 이중 각 각 일치 하는 쌍 조직 샘플;의 욕설에 의해 추정 Ag 농도 = Ci, 디, 그리고이 각 각 일치 하는 쌍 조직 샘플; triplicate 샘플의 욕설에 의해 추정은 Ag 농도 = 내가 n 1 =. 원시 데이터의 대표적인 결과 섹션에서 정확성과 정밀 테스트를 참조 하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
5입니다. 욕설에 의해 Ag 농도의 추정입니다.
<ol><li>간 및 신장 조직 좌초 고래에서 수집 하 고 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정.</li>
	<li>포 르 말린 고정 조직을 일상적으로 처리 (2 단계 참조).</li>
	<li>욕설에 의해 알 수 없는 Ag 농도와 cetacean 간 및 신장 조직의 Ag 농도 추정 (3, 4 단계 참조).</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

문서 연구의 목적은 suborgan 수준에서 Ag 배포를 평가 하 고 cetacean 조직에 Ag 농도 추정 하는 보조 메서드를 설정 하는 것입니다. 현재 프로토콜 ICP-MS, 2) AMG 분석 알려진된 Ag 농도와 일치 하는 쌍 조직 샘플의 3) Ag 농도 추정에 대 한 회귀 모델 (욕설)의 설립에 의해 cetacean 조직에 Ag 농도의 결정 1) 포함 AMG 양수 값, 4)에 의해 평가의 정확성과 정밀도 CHAA, 및 5의) 욕설에 의해 Ag의 추정 농도.
이 연구에서 ICP-MS의 데이터 했다 크게 하 고 긍정적으로 상관의 AMG 양수, amg가 양수 값 cetacean 조직에 Ag 농도 예상할 수 있는 제안. 따라서, amg가 양수 값과 회귀 모델에 근거 하는 욕설 고래의 간 및 신장 조직에 Ag 농도 추정에 대 한 개발 되었습니다. 일반적으로, 더 많은 매개 변수 (즉, 더 복잡 한 회귀 모델)을 사용 하 여 회귀 모델, 데이터에 잘 맞는 하지만 그것...

나노 (AgNPs) 섬유, 화장품, 그리고 그들의 위대한 항균 효과1,2인 의료 항목을 포함 하 여 상용 제품에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 따라서, AgNPs와 AgNP 포함 된 제품의 생산 시간이3,4증가 됩니다. 그러나, AgNPs 환경으로 공개 될 수 있습니다 그리고 바다5,6에 축적. 그들은 Ag 오염의 주요 소스 되 고 Ag의 환경 독성에 대 한 대중의 인식을 증가.
해양 환경에서 AgNPs Ag의 상태는 복잡 하 고 끊임없이 변화입니다. 이전 연구 AgNPs 입자, 집계, 분해, 반응 화학 종 또는+ Ag 이온7,8에서 다시 생성으로 남아 있을 수 있는 표시 했습니다. 여러 종류의 Ag, AgCl, 등 그들은 생물이 유기 체에 의해 섭취 될 수 있다 하 고 먹이 사슬9,10입력 해양 퇴적 물에서 발견 되었습니다. 대만의 남서 해안을 따라 치 구 라군 지역에서 실시 이전 연구, 해양 퇴적 물의 Ag 농도 매우 낮고 crustal 풍요에 유사한 그리고 그 생선 간 조직의 일반적으로 검출 아래 제한 (&lt; 0.025 μ g/g 습식/습식)11. 그러나, 다른 국가에서 이전 연구는 간의 상대적으로 높은 Ag 농도 고래12,13의 설명 했다. 고래는 간은에서 Ag 농도 연령에 따라, 그들의 시체에 Ag의 소스는 대부분 그들의 먹이12제안 이다. 이 결과 더 높은 영양 수준에서 동물에 Ag의 biomagnification을 좋습니다. 고래, 바다에서 정점 육 식으로 수 있습니다 고통을 할 Ag/Ag 화합물12,,1314로 인 한 부정적인 건강에 미치는 영향. 가장 중요 한 것은, 고래, 처럼 인간은 포유동물, 및 부정적인 건강 영향 고래에 Ag/Ag 화합물으로 인 한 인간에서도 발생할 수 있습니다. 즉, 고래 해양 환경 및 인간 건강에 대 한 센 티 넬 동물 수 있습니다. 따라서, 건강 효과, 조직 분포 및 고래에 Ag의 농도 큰 관심사.
ICP-MS를 사용 하 여 높은 자본 비용 (악기 및 유지 관리) 및 조직 스토리지에 대 한 요구 사항에 의해 제한 cetacean 조직에 Ag/Ag 화합물의 농도 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학 (ICP-MS)에 의해 측정 될 수 있다, 비록 /preparation12,15. 또한, 그것은 일반적으로의 물류 어려움, 부족 인력, 관련된 리소스12의 부족으로 좌초 cetacean 경우 모든 조사에서 포괄적인 조직 샘플을 수집 어렵습니다. 냉동된 조직 샘플 ICP MS 분석에 대 한 제한 된 냉동 공간 때문에 쉽게 저장 되지 않습니다 그리고 냉동된 조직 샘플 깨진된 냉장 장비12인해 삭제 될 수 있습니다. 이러한 상기 장애물 ICP MS 분석 냉동된 조직 샘플을 사용 하 여 오염 수준 cetacean 조직에서의 수사를 방해. 반면, 포 르 말린 고정 조직 샘플은 상대적으로 죽은 좌초 고래의 검 시 동안 수집 하기 쉽다. 따라서, 그것은 포 르 말린 고정 조직 샘플을 사용 하 여 cetacean 조직에서 중 금속 검출/측정 하는 사용 하기 편한 하 고 저렴 한 방법을 개발 하는 데 필요한.
Suborgan 분포 및 농도의 알칼리 그리고 알칼리 성 지구 금속 포 르 말린 고정 하는 동안 변경 될 수 있습니다, 비록 파라핀 포함 (FFPE) 과정, 전이 금속, Ag에 낮은 효과 지적된16있다 합니다. 따라서, FFPE 직물 금속 현지화 및 측정16,17에 대 한 이상적인 샘플 자원으로 간주 되었습니다. Autometallography (AMG), 조직화 학적인 과정 FFPE 직물 단면도에 검은 AMG 긍정적인 신호를 변함없이 크기의 황금 노란색으로 중 금속을 증폭 수 있습니다 및 이러한 증폭 된 중 금속은 가벼운 현미경 검사 법18, 에서 구상 될 수 있다 19 , 20 , 21. 그러므로, AMG 메서드 중 금속의 suborgan 배포판에 정보를 제공 합니다. 그것은 ICP MS만 기관 레벨18에 중 금속의 농도 측정할 수 있기 때문에 생물 학적 시스템에서 중 금속의 대사 경로 공부에 대 한 중요 한 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 또한, 디지털 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ, 같은 조직학 조직 섹션22,23의 정량 분석에 적용 되었습니다. FFPE 직물 단면도의 검은 AMG 긍정적인 신호를 변함없이 크기의 황금 노란색 정량 고 중 금속의 농도 추정 하는 데 사용 될 수 있습니다. 회귀 모델 이미지 정량 분석 및 ICP-MS, cetacean 라는에서 얻은 데이터를 기반으로 예상할 수 있는 절대 Ag 농도 이미지 정량 분석 AMG 메서드에서 직접 결정 될 수 없다, 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)입니다. ICP MS 분석 가장 좌초 고래에 의해 Ag 농도 측정에 어려움을 고려 하면 CHAA는 Ag 농도 cetacean 조직, ICP MS 분석의 부족에 의해 결정 될 수 없다 추정 하 귀중 한 보조 방법 냉동 조직 샘플입니다. 이 종이 suborgan 수준 및 고래의 간 및 신장 조직에 Ag 농도 추정 하는 욕설 이라는 분석 결과에서 Ag 지역화에 대 한 조직화 학적인 기법 (AMG 방법)의 프로토콜을 설명 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig1.jpg"> 그림 1: Ag 농도 추정에 대 한 설립 및 cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설)의 응용 프로그램을 묘사 하는 순서도. CHAA cetacean 조직학 Ag 분석 결과, FFPE = = 포 르 말린 고정 파라핀 포함, ICP MS = 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>HQ 실버 강화 키트</td><td>나노 프로브</td> <td># 2012</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>파라핀</td></tr><tr><td>100 % 에탄올</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>4026</td><td></td></tr><tr><td>Non-Xylene</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>4328</td><td></td></tr><tr><td>실란 코팅 슬라이드</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>511614</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리 (25 x 50 mm)</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>24501</td><td></td></tr><tr><td>Malinol</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>20092</td><td></td></tr><tr><td>GM Haematoxylin Staining</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>3008-1</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린 용액</td><td>Chin I Pao Co., Ltd</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Tip (1000 &mu; L)</td><td>엠디비오, Inc.</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN 클래식 P1000</td><td>길슨, Inc.</td><td></td><td></td>F123602</tr><tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>GeneDireX, Inc.</td><td>PC115-0500</td><td></td></tr><tr><td>Dogfish liver</td><td>National Research Council of Canada</td><td>DOLT-2</td><td></td></tr><tr><td>Dogfish muscle</td><td>National Research Council of Canada</td><td>DORM-2</td><td></td></tr><tr><td>Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS)</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>PE-SCIEX ELAN 6100 DRC</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 6리터 동결 건조 시스템</td><td>Labconco</td><td>7752030</td><td>동결 건조용</td></tr><tr><td>BRAND&reg; SILBERBRAND 용량 플라스크</td><td>Merck</td><td>Z326283</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 표준 바이알, 33 mm 클로저가 있는 평평한 내부</td><td>Savillex Corporation</td><td>200-030-12</td><td>diagestion</td></tr><tr><td>Nitric acid, superpur&reg;, 65.0%</td><td>Merck</td><td>1.00441</td><td>diagestion</td></tr><tr><td>Hot Plate/Stirrers</td><td>Corning&reg;</td><td>PC-220</td><td>다이아메션용</td></tr><tr><td>고전단 실험실 믹서</td><td>Silverson</td><td>SL2T</td><td>균질화용</td></tr><tr><td>멸균 폴리프로필렌 샘플 항아리(250mL)</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>6186L05</td><td>균질화</td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Nikon Corporation</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Nikon Corporation</td><td>ECLIPSE Ni-U</td><td></td></tr><tr><td>Shandon&trade; 기교&거래; 325 수동 마이크로톰</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>A78100001H</tr><tr><td>Accu-Cut&reg; SRM&트레이드; 200 로터리 마이크로톰</td><td>Sakura</td><td>1429</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드 S35</td><td>FEATHER&reg;</td><td>207500000</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 염색 접시 및 커버</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3215</td><td></td></tr><tr><td>스틸 염색 랙</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3003</td><td></td></tr><tr><td>Shandon 임베딩 센터</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>S-EC</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Citadel&reg; 조직 처리기</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>69800003</tr><tr><td>슬라이드 워머</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>26005</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Shandon Capshaw</td><td>3964</td><td></td></tr><tr><td>필터 페이퍼</td><td>Merck</td><td>1541-070</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6.01 for windows</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td>통계 소프트웨어</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 조직 임베딩 금형</td><td>Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd</td><td>RD-TBM003</td><td>파라핀 emedding용</td></tr></tbody></table>

지역화를 autometallography 및 cetacean 조직에 실버 반 계량의 사용

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

나노 (AgNPs) 섬유, 화장품, 그리고 그들의 강력한 항균 효과 인해 의료 항목을 포함 하 여 상용 제품에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그들은 또한 환경에 공개 될 수 있습니다 하 고 바다에 축적. 따라서, AgNPs는 Ag 오염의 주요 원천 및 Ag의 환경 독성에 대 한 대중의 인식을 증가. Ag의 (에서 소비자/육 식 동물) 확대 및 bioaccumulation (생산자)에 이전 학문은 설명 했다. 고래, 바다의 정점 육 식으로 수 있습니다 부정적인 영향 되었습니다 Ag/Ag 화합물에 의해. Cetacean 조직에 Ag/Ag 화합물의 농도 유도 결합된 플라즈마 질량 분광학 (ICP-MS)에 의해 측정 될 수 있다, 비록 ICP MS를 사용 하 여 높은 자본 비용 및 조직 스토리지/준비에 대 한 요구 사항에 의해 제한 됩니다. 따라서, autometallography (AMG) 메서드를 사용 하 여 이미지 정량 분석 포 르 말린 고정, 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 suborgan 수준에서 Ag 배포를 지역화 하 고 cetacean에 Ag 농도 추정 하는 보조 방법 있을 수 있습니다 조직입니다. AMG 긍정적인 신호 근 신장 관 상피, hepatocytes, Kupffer 세포의 세포질에 다양 한 크기의 검은 알갱이를 주로 갈색입니다. 때때로, 일부 비정 질 황금 노란색 갈색 AMG 긍정적인 신호는 루멘과 일부 근 신장 tubules의 지하실 막에 설명 되어 있습니다. Ag 농도 추정에 대 한 분석 결과 Cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설), AMG 방법 및 ICP-MS의 이미지 정량 분석에서 데이터에 의해 설립 하는 회귀 모델은 이름은입니다. AMG 지역화 CHAA와 반 계량 중 금속 사용 spatio 시간적 및 크로스-종 연구에 대 한 편리한 방법론을 제공 합니다.

Cetacean 간 및 신장 조직에 AMG 긍정적인 신호의 대표 이미지는 그림 5에 나와 있습니다. AMG 긍정적인 신호 근 신장 관 상피, hepatocytes, Kupffer 세포의 세포질에 다양 한 크기의 검은 알갱이 변함없이 크기의 갈색을 포함합니다. 때때로, 아 몰 퍼스 황금 노란색 갈색 AMG 긍정적인 신호 루멘과 일부 근 신장 tubules의 지하실 막에 설명 되어 있습니다. ICP-MS의 결과 간 및 신장 조직, AMG 양성 값 사이 긍정적인 상관 관계 이며 원점 통과 선형 회귀 여분의 합계의 사각 F 테스트 및 AIC12,26, 선호 27. 정확도 테스트에서 SDs 간 및 신장에 대 한 욕설의 뜻은 3.24 및 0.16, 각각. 정밀 ...

프로토콜 cetacean 간 및 신장 조직에 Ag를 지역화 하려면 autometallography에 의해 제공 됩니다. 또한, cetacean 조직학 Ag 분석 결과 (욕설) 라는 새로운 분석 결과 그 조직에 Ag 농도 견적 하기 위하여 개발 된다.

지역화를 Autometallography 및 Cetacean 조직에 실버 반 계량의 사용

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

이 방법은 생물학적 시스템 내의 중금속 의 하위 기관 분포 및 농도에 대한 환경 독성학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 AMG가 사용하기 쉽고 저렴한 방법론이며, 이는 조직에서 중금속을 조사하기위한 귀중한 보조제라는 것입니다. 우리는 돌고래와 고래의 조직을 사용하여 프로토콜을 보여줍니다.그러나, 우리는 프로토콜이 다양한 동물 종에서 사용될 수 있다고 믿습니다. 웬타 리와 함께 절차를 시연하는 것은 우리 연구소의 임상의인 순성(Shun Theng)이 될 것입니다. 좌초된 세타산으로부터 AMG 분석을 위한 쌍 매칭 간 및 신장 조직을 수집하고, 조직을 24~48시간 동안 10%의 중성 완충 포르말린의 10배 부피로 고정하는 것으로 시작한다.다음으로, 일회용 스테인리스 스틸 마이크로톤 블레이드를 사용하여 포르말린 고정 간 및 신장 조직을 1센티미터, 3mm 구간으로 2센티미터로 자르고 동일한 개인의 간과 신장 섹션을 동일한 라벨이 부착된 카세트에 배치합니다. 일련의 등급에 등급이 매겨진 에탄올과 자일렌 몰입을 통해 조직 프로세서의 섹션을 탈수하고 1 시간 2 시간 파라핀 몰입을 합니다. 2 시간 파라핀 침지 후, 조직을 강철 조직학 금형의 바닥으로 옮기고 탈수 된 조직 샘플을 신선한 녹은 파라핀으로 포함시킴을 포함시킴이 됩니다.파라핀이 고화될 때까지 파랭판에 고정된 파라핀 내장 조직 블록을 차갑게 하고, 조직 표면이 노출될 때까지 마이크로토메에서 각 블록을 다듬습니다. 샘플을 영하 20도에서 10분간 식히고 마이크로톤에 5마이크로미터 의 조직 섹션을 가져옵니다. 핀셋과 브러쉬를 사용하여 조직 섹션의 리본을 획득할 때 들어 올리고 분리 될 때까지 섭씨 45도의 이중 증류 수조 표면에 띄우고 개별 현미경 슬라이드에 놓습니다.그런 다음 슬라이드를 섭씨 60도에서 1시간 동안 미끄럼온에 놓습니다. 그런 다음 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓고 8-5 및 3 분 잠복식을 위해 순수 비 자일렌 200 ~250 밀리리터를 포함하는 세 가지 염색 요리에 섹션을 분리합니다. 등급에 매겨진 에탄올 용액의 다른 염색 접시에 탈 파라피화 샘플을 수분화한 다음 이중 증류수에서 헹구는 것입니다.PBS에서 섹션을 한 번 헹구면 5% Triton X 100, PBS에서만 여러 번, 세척당 30초 동안 신선한 이중 증류수로 한 번 보충합니다. 마지막 세척 후 각 샘플을 300 마이크로리터의 혼합 은 개선 키트 솔루션으로 라벨을 부착하여 실온에서 어둠 속에서 15분 이상 라벨을 붙입니다. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 이중 증류수로 세척하고 슬라이드당 300 마이크로리터의 헤마톡시린을 10초 동안 반소 얼룩지게 합니다.흐르는 수돗물로 슬라이드를 씻으십시오. 건조하고 장착 매체로 섹션을 장착합니다. 그런 다음, 각 조직 섹션의 10 무작위 조직 학적 이미지를 캡처, 빛 현미경의 40X 목표에 따라.자동 메타알로그래피 또는 AMG를 분석하려면 시료의 긍정성, 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에서 이미지를 열고 이미지, 유형 및 RGB 스택을 선택하여 첫 번째 이미지를 빨간색, 파란색 및 녹색 색상 채널로 분할합니다. 블루 채널에서, 이미지를 선택, 조정 및 임계값, 각 이미지에서 AMG 양성 신호와 영역의 백분율을 측정, 수동으로 핵, 또는 적혈구에 거짓 양성 영역의 존재에 따라 각 이미지의 임계 값에 대한 컷오프 값을 조정. 분석을 클릭하고 측정을 설정하고 영역 분수를 확인하여 영역 분획이 기록됨을 지정합니다.분석 및 측정을 클릭하여 결과 창의 각 조직학적 이미지 백분율 영역 열의 양수 백분율 영역 열을 표시합니다. 유도 결합된 플라즈마 질량 분광법과 AMG 양성 값 간의 상관 관계를 평가하려면 적절한 그래프 소프트웨어를 엽니다. 새 프로젝트 파일을 만들고 XY 및 상관 관계를 선택합니다.유도 결합된 플라즈마 질량 분광법 및 AMG 분석의 결과를 입력하고, 분석 및 상관관계를 선택하여 Pearson 상관 관계 분석에 의한 분석 결과 간의 연관성 강도를 분석한다. 매개 변수에서 비선형 회귀 창에서 적합 페이지에서 다른 회귀 모델을 선택하고 비교 페이지에서 비교 방법을 선택합니다. 제곱 F 테스트의 추가 합계와 아카이케의 정보 기준을 포함합니다.비교 방법의 결과에 따르면, 세타산 조직학적 은 분석에서 비교적 적합한 회귀 모델을 선택하고, 알 수 없는 은 농도를 가진 세타산 간 및 신장 조직의 은 농도를 추정하기 위해 분석법을 사용합니다. AMG 양성 신호는 간세포와 Kupffer 세포의 세포질에 있는 다양한 크기, 갈색에서 검은 과립을 포함하고, 몇몇 근위 신장 관의 루멘 및 지하실 막에 있는 갈색 AMG 양성 신호에 가끔 무정형, 황금 황색을 포함합니다. 분석된 간 및 신장 조직에서 교원결합 된 혈장 질량 분광법과 AMG 양성값의 결과 사이에는 긍정적인 상관관계가 있으며, 기원을 통한 바람직한 선형 회귀와 함께, 제곱 F 테스트의 추가 합계에 따라, 그리고 아카이케의 정보 기준.이 절차를 시도하는 동안 AMG 방법은 보조 방법이며 ICPMS와 같은 다른 특정 방법과 함께 조직의 중금속 의 실제 구성을 모니터링하는 데 사용해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

use-autometallography-to-localize-semi-quantify-silver-cetacean

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

출처: Hare, D. J., et.al.  레이저 절제에 의한 뇌 조직의 금속 이미징 - 유도 결합 플라즈마 - 질량 분석법(LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 레이저 절제 유도 결합 플라즈마-질량 분석법(LA-ICP-MS)을 사용하여 마우스 뇌 조직의 금속 분포를 시각화하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 샘플 입자의 에어로졸을 생성하기 위한 레이저 절제, 고온 플라즈마에서 입자의 이온화, 질량 대 전하 비율로 이온을 분리하는 질량 분석법이 포함됩니다. 그런 다음 특수 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지를 생성하여 조직 내 금속의 공간 분포를 드러냅니다.

Laser Ablation-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry를 통해 마우스 뇌 조직의 금속을 시각화

이 논문은 공간적으로 상관 된 화학적 구조, 및 나노 인 덴 테이션을 사용 Atractosteus 헤라의 다층 스케일 (A. 주걱)의 기계적 특성을 프로빙을 위해 사용 방법을 제시, 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 분광 분석, 주사 전자 현미경 (SEM) 및 X- 선 단층 촬영 (X 선 CT)을 계산. 실험 결과는 보호 생물 재료의 설계 원리를 조사하는 데 사용되었다.

다층 물고기 비늘 (의 특성<em&gt; Atractosteus 주걱</em&gt;) 나노 인 덴 테이션, X-선 CT, FTIR, 및 SEM을 사용하여

이 프로토콜은 고래류의 미오글로빈에 강하게 반응하는 두 개의 IgG 클래스 단클론 항체(mAb)의 개발을 설명합니다. 이러한 mAb는 샌드위치 형식을 기반으로 하는 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립에 적용되어 고래류의 Mb를 바다표범 및 다른 동물과 구별합니다.

고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

배아 단계는 생체이물(xenobiotics)에 가장 취약합니다. 화학적 독성은 염도에 따라 다르지만 수생 생물에 대한 독성의 염분 의존성을 테스트하는 방법은 없습니다. 여기에서는 수생 배아에 대한 독성의 염분 의존성을 결정하기 위한 새롭고 높은 처리량의 방법을 설명합니다.

메다카 계란을 사용하여 실버 Nanocolloids의 염도에 의존하는 독성 분석

유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 연결된 크기 배제 크로마토그래피는 생물학적 시료에서 직접 금속 단백질의 다양성 변화를 측정할 수 있는 강력한 도구입니다. 여기에서는 분자 질량 및 알려지지 않은 단백질과 관련된 금속의 양을 추정하는 데 사용되는 일련의 금속 단백질 표준물질에 대해 설명합니다.

크기 배제 ICP-MS를 이용하여 정량적 Metalloproteomic 분석을위한 표준

수중 환경에서 미량 금속 연구를 위해 물 샘플을 적절하게 수집하고 처리하기 위해서는 "깨끗한 기술"을 사용하는 특별한 주의가 필요합니다. 상세한 미량 금속 연구를 위해 신뢰할 수 있는 환경 모니터링 데이터와 높은 감도의 결과를 얻기 위한 샘플링, 처리 및 분석 절차를 위한 프로토콜이 제시됩니다.

클린 샘플링 및 추적 금속 연구 강 하구 바다의 분석

정량적으로 레이저 어블 레이션에 의해 조직에 금속을 매핑 - 유도 결합 플라즈마 - 질량 분석 (LA-ICP-MS)는 금속이 정상적인 기능과 질병 과정에 참여하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 민감한 분석 기술이다. 여기, 우리는 정량적 마우스 신경 조직의 얇은 섹션에서 금속 이미징을위한 프로토콜을 설명합니다.

유도 결합 플라즈마 - - 레이저 박리에 의한 뇌 조직의 이미징 금속 질량 분석 (LA-ICP-MS)

우리는 튜브웜인 Hydroides elegans의 석회화를 관찰하고 최초의 석회화된 물질을 찾고 특성화하는 데 유용한 다양한 현미경 방법의 사용을 보여줍니다. 생체 현미경과 전자 현미경을 함께 사용하여 생체 광물화 연구에 중요한 기능 및 재료 정보를 제공합니다.

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

플랑크톤과 중단된 한 입자는 바다 생물 지구 화학적 순환에 중요 한 역할을 재생합니다. 여기, 우리 해 수의 큰 볼륨을 처리 하는 능력 입자와 바다에서 플랑크톤의 다양 한 크기의 컬렉션에 대 한 매우 깨끗 하 고 낮은 스트레스 방법을 제공 한다.

크기 분류 한 해양 플랑크톤과 중단된 한 입자를 수집 하기 위해 매우 깨끗 한 다층 기구

우리는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 제조 된 샘플에 도입 된 금속의 쉬운 정량화를위한 분석법을 제시합니다. 이 방법은 하이드록시나프톨 블루를 비대금속 표시기로 사용하고 UV-Vis 분광광도계를 검출기로 사용합니다.

고정화 금속 친화성 크로마토그래피에서 금속 침출정 정량화

이 프로토콜은 고래 관찰 선박에서 고래류 환경 DNA(eDNA) 샘플을 수집하는 표준화된 작업 흐름을 설명합니다. 연구자와 훈련된 시민 과학자의 실현 가능성을 우선시하며, 환경 조건, 여과 시간, 탁도, 그리고 실내적 물류가 적용의 실질적 한계를 정의합니다.

고래류 모니터링을 위한 고래 관찰 선박에서 채취한 환경 DNA 샘플

학습하세요 오토메탈로그래피를 이용한 고래류 간과 신장 조직 내 은 정량화 방법을. CHAA 분석법으로 중금속 독성 연구에 활용할 수 있는 경제적이고 신뢰성 높은 환경독성학 기술을 습득하세요.

지역화를 Autometallography 및 Cetacean 조직에 실버 반 계량의 사용

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