L'obiettivo di ingegneria del tessuto cardiaco attuale è quello di sviluppare una terapia per sostituire o riparare la struttura e la funzione del tessuto del miocardio danneggiato1. Metodi per creare modelli 3D del tessuto cardiaco che esibiscono le importanti proprietà contrattili ed elettrofisiologiche del tessuto cardiaco nativo sono stati rapidamente in espansione2,3. Una varietà di strategie sono stati esplorati e utilizzati in studi4,5. Questi vanno di metodi dall'uso di specifici idrogeli bioattivi naturali e sintetici, come gelatina, collagene, fibrina e peptidi6, a bio-inchiostro deposizione tecnologie2 e multimateriali tecnologie7.
È stato dimostrato che senza impalcatura metodi possono produrre tessuti paragonabile come metodi basati su biomateriale, senza gli svantaggi di incorporare ponteggi stranieri materiale8. Oren Caspi et al hanno dimostrato che l'incorporazione di vari tipi di cellule consente la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano altamente vascularized9. Mento et al ha sviluppato un metodo di stampa 3D per la creazione di patch cardiaci di sferoidi. Le patch risultante sono composte di cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali in un rapporto di 70:15:1510. Sferoidi sono stati indicati per essere efficaci "building blocks" della creazione del tessuto cardiaco senza impalcatura, come essi sono resistenti contro ipossia e possedere sufficiente integrità meccanica per l'impianto11,12. Gli studi precedenti hanno dimostrato parecchi metodi di fabbricazione per la creazione di sferoide, compreso l'uso dell'impiccagione drop metodo, spinner boccette13, di sistemi microfluidici14e antiaderente cultura superfici non rivestite o rivestite con agarosio micro-stampi15. In questo protocollo, usiamo l'impiccagione dispositivo di discesa, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta.
Questo studio presenta un romanzo e l'efficiente metodo senza impalcatura per la creazione di tessuto cardiaco, che comprende il seeding manualmente sferoidi in una cavità dello stampo quadrato e incubando il tessuto su un agitatore per maturazione. In condizioni di coltura statica usuale, diffusione dell'ossigeno è limitato agli aspetti esterni del costrutto del tessuto, con conseguente necrosi centrale. Tuttavia, con la muffa netta, tutte le sferoidi seminati nello stampo sono immersi nei media con un costante movimento fluidico, consentendo per la maggiore diffusione di sostanze nutritive e di ossigeno. Inoltre, questo metodo basato su stampo consente la creazione simultanea di patch di tessuto di diverse dimensioni con il minimo sforzo manuale e il tessuto risultante può essere facilmente rimosso dallo stampo. Questo nuovo metodo consente la creazione efficiente e riproducibile di patch cardiache senza impalcatura, multistrata.
Questo protocollo descrive un metodo innovativo e semplice basato su uno stampo per la creazione di tessuti cardiaci tridimensionali, che utilizza sferoidi come strumento per la generazione di tessuti cardiaci senza l'uso di scaffold. Nei nostri esperimenti, tre tipi di cellule — cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane, fibroblasti cardiaci umani e cellule endoteliali da vena ombelicale umana — sono stati isolati e utilizzati per generare una sospensione cellulare. Con il 70% di cardiomiociti, il 15% di fibroblasti e il 15% di cellule endoteliali, in un tubo conico da 50 mL.
Successivamente, distribuiamo la sospensione cellulare in ciascun pozzetto di un sistema a goccia sospesa con adesione ultra ridotta, che porterà alla formazione spontanea di centinaia di sferoidi pulsanti dopo tre giorni. Gli sferoidi vengono quindi raccolti e posizionati in una nuova cavità dello stampo. Il tessuto viene quindi mantenuto in un contenitore sterile con mezzo di coltura, su un agitatore all'interno dell'incubatore per diversi giorni.
Il modello viene successivamente rimosso, ottenendo una toppa di tessuto senza impalcatura con integrità meccanica. Il dispositivo a go