現在の心臓組織工学の目的は、交換または構造と負傷した心筋組織1の機能を修復する治療法を開発することです。ネイティブの心臓組織の重要な収縮と電気生理学的特性を示す心筋組織の 3次元モデルを作成する方法には2,3を急速に拡大しています。様々 な戦略を模索、研究4,5で使用されます。これらの方法はゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ペプチド6などの合成と天然特定の生理活性物質ゲルの使用からバイオ インク蒸着の技術2バイオプリンティング技術の7まであります。
足場自由な方法が外部足場材料8を組み込むことの欠点がなく、生体材料ベースのメソッドとして匹敵する組織を作り出すことができることが示されています。オレン カスピーらは、種々 の細胞の結合が高度に血管人間設計された心臓ティッシュ9の生成を有効を示した。あごらは、回転楕円体から心臓のパッチを作成するための 3次元印刷法を開発しました。結果として得られるパッチ参照比10で血管内皮細胞、線維芽細胞、心筋細胞で構成されます。回転楕円体は、効果的な「ビルディング ブロック」足場無料心臓組織の作成の彼らの低酸素状態に対する耐性があるし、注入11,12の十分な機械的完全性を持って示されています。以前の研究は、回転楕円体を作成するためのいくつかの製造方法を示している、絞首刑の使用を含むドロップ メソッド、スピナー フラスコ13、マイクロ流体システム14、および非付着性文化の表面光沢をめっきしたものアガロース マイクロ金型15。このプロトコルでは絞首刑を使用してドロップ デバイスは、一度に何百もの回転楕円体を凝縮の細孔が含まれています。
本研究は、小説と正方形の金型に、回転楕円体を手動でシードとシェーカーで組織の成熟をインキュベートを含む心臓組織の創造のための効率的な足場無料メソッドを示します。いつも静置培養条件下で酸素の拡散は中心壊死をもたらす組織構成要素の外側の側面に限定されます。ただし、ネット型で金型にシードすべての楕円は、栄養素や酸素の増加の拡散を可能にする一定の流体運動とメディアに没頭しています。また、この金型ベースのメソッドは、最小限の労力でサイズの異なる組織パッチの同時作成、金型から得られた組織を簡単に削除できます。この手法スキャフォールド フリー、多層の心筋パッチの効率的かつ再現可能な作成できます。
本プロトコルでは、スフェロイドを足場材なしでの心臓組織構築のツールとして利用する、新規かつ簡便なモールドベースの3次元心臓組織作製法について解説します。本実験では、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、ヒト心臓線維芽細胞、およびヒト臍帯静脈内皮細胞の3種類の細胞を単離し、細胞懸濁液の作製に使用しました。50MLコニカルチューブ内で、心筋細胞70%、線維芽細胞15%、内皮細胞15%の割合で混合しました。
次に、細胞懸濁液を超低接着ハングドロップシステム（hanging drop system）の各ウェルに分注します。これにより、3日後には数百個の拍動するスフェロイドが自然に形成されます。その後、スフェロイドを回収し、新規のモールドキャビティに配置します。そして、組織を培地とともに滅菌容器に入れ、インキュベーター内のシェーカーで数日間維持します。
その後、型を取り除くことで、機械的整合性を備えたスキャフォールドフリーの組織パッチが得られます。ハンギングドロップデバイスは、直径350 micronsのマイクロ孔を850個持つ、再利用可能な超低接着ウェルです。このハンギングドロップは、標準的な6ウェルプレートに対応しています。
細胞懸濁液を作製後、1,000万個の細胞を含む細胞懸濁液 4 mL を、ハンギングドロップシステムの各ウェルに分注します。デバイスを 37 °C、5% CO2、および 95% 湿度条件下で培養します。72 時間後、平均直径 350 µm の拍動するスフェロイドが自発的に形成されることが観察されます。
吊り滴デバイスを培地を入れた別のディッシュに入れ、穏やかに回転させてスフェロイドを遊離させ、吊り滴システムの底にある孔から流出させることで、スフェロイドを回収します。これは、三次元の足場フリー心臓組織作製のための新規モールドの概略図です。これには、ハンドリングマット、充填ベース、および新規モールドが含まれています。
この新型モールドは、ベース、底面の正方形プレート、底面ネット、および微細なステンレス製 prong で構成された10層の側面ネットで構成されています。さらに、上面ネット、上面正方形プレート、保持チューブ、およびストッパーピンが含まれます。この新型モールドシステムでは、2 mm × 2 mm、4 mm × 4 mm、6 mm × 6 mm を含む、さまざまなサイズの組織を作製することが可能です。
ベースの底面正方形プレートと底面ネットを、コーナーポストを用いて重ねて整列させます。次に、滅菌ピンセットを用いて、サイドネットを交互の方向に10層重ね、ステンレス製の微細な prong ネットを作成します。その後、スフェロイドを新型モールドに配置する前に、表面張力を低減させるため、充填ベースを1X リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。
新しいモールドキャ