Цель текущего инженерии сердечной ткани является разработка терапии замены или ремонта структуры и функции пораженных тканей миокарда1. Методы для создания моделей 3-D сердечной ткани, экспонирование важные сократительной и электрофизиологические свойства родной сердечной ткани быстро расширяет2,3. Разнообразные стратегии были изучены и использованы в исследованиях4,5. Эти методы варьируются от использования конкретных синтетических и натуральных биоактивных гидрогели, например6желатин, коллаген, фибрина и пептиды, био чернил осаждения технологий2 и подложке технологии7.
Было показано, что леска бесплатные методы могут производить сопоставимые тканей как методы на основе биоматериала, без недостатков включения иностранных леса материала8. Орен Caspi et al. показали, что включение различных видов клеток позволяет поколения высоко васкуляризированной человеческой инженерии сердечной ткани9. Chin et al. разработали метод 3-D печати для создания сердца патч от сфероидов. Результате патчей состоят из кардиомиоцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток в 70:15:15 соотношение10. Сфероидов было показано, чтобы быть эффективным «строительные блоки» бесплатно эшафот сердечной ткани творения, как они устойчивы к гипоксии и обладают достаточной механической целостности для имплантации11,12. Предыдущие исследования показали несколько методов изготовления для создания сфероида, включая использование висит drop метод, спиннер колбы13, microfluidic систем14и non сторонник культуры поверхностей без покрытия или с покрытием агарозы микро формы15. В этом протоколе, мы используем висит падение устройство, которое содержит микропоры для конденсации сотни сфероидов в одно время.
Это исследование представляет собой Роман и эффективного эшафот, свободной метод для создания сердечной ткани, которая включает в себя вручную посева сфероидов в полости квадратные формы и инкубации ткани на шейкер для созревания. В условиях обычной статической культуры диффузия кислорода ограничивается внешние аспекты конструкции ткани, что приводит к центральной некроза. Однако с чистой формы, все сфероидов посеяны в плесень погружаются в СМИ с постоянной аэрогидродинамических движения, что позволяет для широкого распространения питательных веществ и кислорода. Кроме того этот метод на основе форм позволяет одновременное создание патчей тканей разного размера с минимальными усилиями ручной и результирующая ткань может быть легко удалена из формы. Этот новый метод позволяет для создания эффективной и воспроизводимые эшафот бесплатно, многослойные сердечной патчей.
В данном протоколе описывается новый и простой метод создания трехмерной сердечной ткани с использованием формы, где сфероиды применяются в качестве инструмента для создания сердечной ткани без использования каркаса. В наших экспериментах были выделены три типа клеток — кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, сердечные фибробласты человека и эндотелиальные клетки пупочной вены человека, которые были использованы для приготовления клеточной суспензии. В конической пробирке объемом 50ML была подготовлена смесь, содержащая 70% кардиомиоцитов, 15% фибробластов и 15% эндотелиальных клеток.
Затем мы распределяем суспензию клеток по каждой лунке системы висячих капель с ультранизкой адгезией, что приведет к спонтанному формированию сотен сокращающихся сфероидов через три дня. После этого сфероиды собирают и помещают в полость специальной формы. Затем ткань поддерживают в стерильном контейнере со средой на шейкере в инкубаторе в течение нескольких дней.
Затем форму удаляют, в результате чего получается тканевый лоскут без поддерживающего каркаса, обладающий механической целостностью. Устройство для метода висячей капли представляет собой многораз