Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op een breed scala van gebieden die voorwaardelijke en voorbijgaande inactivatie van een gen van belang vereisen door een dominante negatieve versie ervan omgekeerd over-uit te drukken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het slechts een gedeeltelijke ablatie in eiwitactiviteit toestaat, dus, het behoud van een resterende endogene expressie. Hoewel we hier de conditie inactivatie van RB-eiwit beschrijven, die functioneert in een multimerieke assemblage, kan deze methode ook worden toegepast op monomeereiwitten.

Umesh Pyakurel, ons laboratorium techinician en een coauteur in het manuscript zal de procedures demonstreren. Om te beginnen groeien NIH3T3 cellen, volgens de specificaties van de leverancier, op 37 graden Celsius met 5% CO2, met behulp van de aanbevolen celkweek medium met 10% foetale runderserum. Om de cellen met pTet-Splice en pCMV-Tet3G vectoren samen te brengen, meng je eerst twee tot vier microliters van het op lipide gebaseerde transfectiereagens per put, en één milliliter onvolledige DMEM per put in een buis van 15 milliliter en broed gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Voeg twee tot drie microgram plasma-DNA per put toe aan de DMEM-mix van dit transfectiereagens. Meng en broed gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Voeg een milliliter van de mix met DNA en de transfectie reagens in DMEM aan elke put van zes-put plaat met NIH3T3 cellen.

Na drie tot vier uur incubatie bij 37 graden Celsius met 5%CO2, voeg een milliliter van volledig medium. Voeg vervolgens 2 microliters doxycycline voorraad toe aan elke put en markeer de plaat als plus-doxycycline. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5%CO2.

Om de functionaliteit van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 constructie te beoordelen in het bevorderen van ongeplande celproliferatie, cultuur HEI-OC1 cellen in DMEM met 10%FBS, onder tolerante omstandigheden. Voor celproliferatiestudies telt u de HEI-OC1-cellen met behulp van een celteller. Plaat 10.000 HEI-OC1 cellen per put op een 96-put plaat in 200 microliters van volume elk.

Broed de cellen 's nachts uit op 33 graden Celsius met 5%CO2. Om transgene expressie te induceren, voeg een microgram per milliliter doxycycline toe aan een subset van transfected HEI-OC1 cellen. Gebruik de andere subset gelabeld als min-doxycycline en de niet-transfected HEI-OC1 cellen als controles, en incubeer de cellen als 33 graden Celsius met 10% CO2.

Om celproliferatie te beoordelen, 48 uur na transfectie, verwijder het celkweekmedium en voeg 100 microliter van 1x kleurstofbindingsoplossing toe aan een celproliferatiekit aan elke put van de microplaat. Volg het protocol van de fabrikant en broed gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Gebruik een fluorescentie microplate lezer om de fluorescentie intensiteit van elk monster te meten.

Om de celproliferatie verder te beoordelen met behulp van immunocytochemie, plaat de HEI-OC1 cellen op een cover glas geplaatst in elke put van een 12-well plaat in DMEM. Broed de cellen 's nachts bij 33 graden Celsius. Op de volgende dag, cotransfect naar de cellen in twee putten met de pTet-Splice en de pCMV-Tet3G vectoren, en voer vervolgens de doxycycline behandeling op een goed als gedaan met de NIH3T3 cellen.

Gebruik een onverzettede goed als een controle. Als u de cellen voor Ki-67-etikettering wilt verwerken, bevestigt u ze met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Daarna, was ze drie keer met ijskoude PBS gedurende vijf minuten per stuk.

Voeg 0,25% nonionisch wasmiddel toe in PBS en broed gedurende 10 minuten uit. Herhaal de was drie keer in PBS gedurende elk vijf minuten. Gebruik 10% serum om de cellen te blokkeren.

In een bevochtigde kamer gedurende een uur op kamertemperatuur. Voeg 500 microliters van Ki-67 primaire antilichaam en incubbate 's nachts op vier graden Celsius. Was de cellen opnieuw drie keer in PBS gedurende vijf minuten per stuk.

Voeg een milliliter van het secundaire antilichaam toe en broed de cellen gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker uit. Na het verwijderen van de secundaire antilichaamoplossing, was de cellen opnieuw drie keer gedurende vijf minuten in PBS in het donker. Om de HEI-OC1 cellen te labelen met phalloïdine, incuberen ze in 1:200 phalloidin gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Om de celkernen te labelen, 10 minuten lang de cellen incubeer maken met vijf microgram per milliliter DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de levering van de transgene muizen, genotype de pups met behulp van een primer set specifiek voor de CBRb1 fusie regio zoals beschreven in het manuscript. Ras volwassen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 muizen aan de ROSA-CAG-rtTA en tetrecycline inducer lijn om experimentele DN-CBRb muizen te genereren, en genotype hun nakomelingen zoals beschreven in het manuscript.

NIH3T3 drukt geen endogene RB1-eiwit uit, dus de robuuste RB1-expressie die hier wordt gezien, is te wijten aan transgene inductie in aanwezigheid van Dox, maar niet in zijn afwezigheid, wat de efficiënte activering van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1-mix RB1 construct bevestigt. Hek293-cellen daarentegen hebben endogene RB1-expressie. De toevoeging van doxycycline leidde tot TetO-DN-CB-myc6-Rb1 activatie en RB1 down-regulation.

RB1 expressie werd hervat 21 uur na doxycycline werd verwijderd uit de media. HEI-OC1 cellen gecotransfected met dezelfde vectoren, toonde een bescheiden, maar aanzienlijke toename van het celnummer volgen doxycycline behandeling in vergelijking met transfected cellen niet behandeld met doxycycline, en de onveronfecteerde cellen. Fluorescerende in situ hybridisatie bevestigde de genomische invoeging van TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgene in muizen.

Er was een eerste toename van de totale RB1-eiwitexpressie in slakkenkel van de transgene muizen die drie dagen met doxycycline werden behandeld in vergelijking met de controlegroep. In groepen die gedurende zeven en 10 dagen met doxocycline werden behandeld, werd echter een aanzienlijke vermindering van de RB1-expressie waargenomen. Ongeacht het geanalyseerde weefsel werd een significante vermindering van het RB1-eiwit waargenomen bij transgene muizen die met doxocycline werden behandeld, maar niet in de controlegroep, wat de efficiëntie van de TetO-DN-CB-myc6-RB1-constructie bevestigt.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te controleren of elk van de coderingselementen van de transgene zijn in frame met elkaar. Als de coderingsgebieden van Cathepsin B en retinoblastoom beschreven in dit rapport, bij toeval, buiten beeld verbonden waren, zou het niet het beoogde fusie-eiwit opleveren. Zo moet DNA-sequentie verificatie worden gedaan voordat het transgene injecteren in eencellige muisembryo's.

Na deze procedure kan de alomtegenwoordige CAG-promotor worden vervangen door specifieke promotors om de genfunctie op de specifieke manier van een cel te bestuderen.