Name: 인간 폐 조직에서 ZW10 상호 작용 단백질의 면역 염색의 디지털 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 학습하세요 인간 폐암 조직에서 ZWINT 면역 염색 및 전 슬라이드 디지털 스캐닝 방법을. 고품질 디지털 이미지와 신뢰할 수 있는 결과를 제공하여 암 병리 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 중국 국립 자연 재단 (81500151, 81400121, 81270607, 81541027 및 81501352)과 후베이성 자연 재단 (2017CFB631 호)에 의해 지원되었습니다. 저자들은 구오진, 창민, 리후이, 그리고 우한 구글 생물학 기술 유한공사의 동료들에게 기술 지원에 감사를 표한다. 저자는 또한 언어 편집 무하마드 자말 감사합니다.

여기에 설명된 모든 방법은 우한 대학의 중난 병원과 우한 대학의 인민 병원의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. IHC 슬라이드 준비
<ol><li>실온(RT)에서 24시간 동안 인산완충식염수(PBS)에서 4% 파라포름알데히드에 인간 폐 조직 단편(약 3 x 3cm)을 침지하여 폐 조직 샘플을 고정시.</li>
	<li>실온에서 각각 80, 95%, 100% 에탄올을 15분, 20분, 20분동안 탈수시한다. 마지막으로, 실온에서 각각 20 분 동안 100 % 자일렌 3 x에 조직을 담그다.</li>
	<li>포함을 위해, 30 분 동안 파라핀 (63 °C)에 조직을 담그고 파라핀을 변경하고 또 다른 45 분 동안 조직을 다시 담그십시오. 마지막으로, 파라핀을 다시 변경하고 추가 로 조직을 담그고 1 시간.</li>
	<li>로터리 마이크로토메를 사용하여 조직을 5 μm 두께의 섹션으로 자르고 20 μg/mL 폴리-L-리신 코팅 슬라이드에 놓습니다.</li>
	<li>디왁싱을 위해 슬라이드를 65°C 오븐에 2시간 동안 넣고 디메틸벤젠에 15분 동안 담근 다음 100% 자일렌을 15분 동안 담그십시오.</li>
	<li>100% 에탄올에서 5분 동안 5분 동안 조직 섹션으로 슬라이드에 수화하고, 95% 에탄올에서 5분, 80% 에탄올에서 5분, 70% 에탄올에서 5분, 50% 에탄올로 5분씩 연속 희석된 에탄올로 처리합니다.</li>
	<li>항원 수리를 수행합니다.<ol>
<li>이중 증류H 2O(ddH 2O)로 구연산수리액(20x)을 1x로 희석합니다.</li>
		<li>조직 섹션과 1x 구연산 수리 액 (300 mL)을 항원 수리 상자에 넣고 전자 레인지에서 2 분 동안 고출력으로 가열 한 다음 저전력으로 가열하여 6 분 동안 끓입니다.</li>
		<li>섹션이 실온까지 자연적으로 식힙니다.</li>
		<li>구연산 수리 액을 0.01 M PBS로 교체하고 실온에서 회전 쉐이커에서 5 분 동안 섹션 3 x를 씻으하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>내인성 과산화를 제거하십시오.<ol>
<li>DdH 2 O로 H2O 2~ 3 %의 30 %를 희석하고 슬라이드에 추가하고 (모든 조직을 덮는지 확인) 실온에서 젖은 상자에 슬라이드를 30 분 동안 배양하십시오. 참고 : 젖은 상자는 10 x 15cm의 플라스틱 상자이며 물을 포함 할 수 있습니다.</li>
		<li>슬라이드를 5분 동안 3회 세척하고 실온에서 회전 셰이커에 0.01M PBS를 장착합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>비특이적 항원을 차단합니다.<ol>
<li>농축된 일반 염소 세럼을 PBS로 10% 염소 세럼에 0.1% 트웬 20(PBST)로 희석합니다.</li>
		<li>슬라이드에 10 % 염소 세럼을 넣고 37 °C에서 30 분 동안 젖은 상자에 배양하십시오. 참고: 염소 세럼은 슬라이드의 모든 조직을 덮어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직에 얼룩을 지트하십시오.<ol>
<li>밤새 4°C에서 토끼 항인간 항-ZWINT 항체(1:50)로 슬라이드를 배양한다.</li>
		<li>실온에서 회전 쉐이커에서 0.01 M PBST (1 mL 0.1 % 트웬트 20 1,000 mL PBS)로 5 분 동안 슬라이드를 3 x 세척하십시오.</li>
		<li>슬라이드를 37°C에서 30분 동안 이차 항체(항토끼 검출 시스템, 1:200)로 배양합니다.</li>
		<li>회전 식 셰이커에 0.01 M PBST로 5 분 동안 매번 슬라이드를 3 x 씻으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>면역 염색을 시각화하려면 슬라이드를 신선한 3,3-diaminobenzidine 300 μL에 추가한 다음 실온에서 수돗물로 슬라이드를 씻으십시오. 참고: 염색 정도는 현미경(배율 10X - 40X)으로 모니터링됩니다.</li>
	<li>조직을 카운터 스테인. 실온에서 2 분 동안 hematoxylin 염색 용액으로 슬라이드를 염색한 다음 슬라이드를 수돗물로 15 분 동안 씻으십시오. 참고 : 핵은 현미경 (배율 10X - 40X)에서 파란색으로 나타납니다. 청색 염색정도가 더 강력하면, 염산알코올분화를 3-5s에 사용할 수 있으며, 이어서 조직을 수돗물로 다시 청색으로 헹구어 조직의 눈에 띄는 염색을 용이하게 한다.</li>
	<li>슬라이드를 50% 에탄올에서 5분, 70% 에탄올에서 5분, 에탄올 80% 에탄올에서 2회, 5분 동안 95% 에탄올로 5분, 마지막으로 실온에서 100% 에탄올에 각각 5분씩 2회 탈신합니다.</li>
	<li>투명성을 위해 100% 자일렌이 들어있는 탱크에 15분 동안 담그고 실온에서 15분 동안 100% 자일렌이 함유된 다른 탱크로 섹션을 옮니다.</li>
	<li>밀봉을 위해 중성 껌 50 - 100 μL을 취하고 혼합물에 5 % 자일렌을 추가하십시오 (거품에 섞이지 마십시오). 상기에 언급된 혼합물의 15 μL을 폐 조직 섹션에 첨가한다. 커버 유리로 필름을 밀봉하고 거품을 부드럽게 누릅니다.</li>
</ol>2. IHC 슬라이드의 자동 전체 슬라이드 스캔
<ol><li>밀봉된 슬라이드가 실온에서 12시간 동안 건조되도록 하여 건조시다.</li>
	<li>[밝은 필드] 옵션을 수동으로 선택하고 수동 스캐닝 인터페이스를 입력합니다.</li>
	<li>슬라이드 이름을 수정하고 이미지의 저장 경로를 선택합니다.</li>
	<li>검색 영역을 설정하고 사용자 설정 임계값을 사용하여 샘플 스캔옵션을 선택합니다. 임계값은 약 50이며 스캐닝 영역 확장 값이 200 μm입니다.</li>
	<li>스캔 포커스 값을 설정하고 1050에서 2650까지의 범위의 포커스를 자동으로 선택하고 마지막으로 단일 레이어 모드를선택합니다.</li>
	<li>워크스테이션에서 IHC 슬라이드를 로드하고 자동 스캔을 시작합니다. 참고: 슬라이드가 손상되지 않았는지 확인합니다. 슬라이드를 깨끗하고 반투명하게 유지하고 슬라이드의 먼지, 색종이 및 과도한 실란트 잔류물을 피하십시오. 유리 슬라이드와 커버 슬립에는 마크가 없어야 합니다. 실렌으로 슬라이드를 청소하지 마십시오. 슬라이드의 크기는 표1에 있습니다.</li>
	<li>20배, 40배 또는 100배 배율로 슬라이드의 전체 조직 섹션을 자동으로 스캔합니다.</li>
	<li>전체 슬라이드 스캔이 끝날 때 이미지를 수집하고 저장합니다.</li>
</ol>3. 이미징 소프트웨어에 의한 슬라이드 분석
<ol><li>조직 병리학 이미지 분석 소프트웨어를 시작하고 로컬 컴퓨터를선택합니다.</li>
	<li>검색 데이터를 저장하는 파일을 엽니다.</li>
	<li>범위 2X에서 40X까지의 적절한 줌 레벨을 선택합니다.</li>
	<li>토글 색상을 통해 최적의 콘트라스트를 설정하려면 색상을 조정합니다.</li>
	<li>각 이미지에 관심 있는 부분을 수동으로 동그라미를 치고 이름을 지정합니다. 참고: 예를 들어 한 영역에 동그라미를 치고 종양영역으로 이름을 지정할 수 있습니다.</li>
	<li>플러그인 및 QC를선택합니다. 이 때 시나리오 작성기 팝업입니다.</li>
	<li>밀도 퀀트를 선택하고 감지 막대를 조정합니다. 참고: 이 프로세스는 신중하게 수행해야 합니다. 청색 공차의 막대는 세포 핵의 색깔을 조정하기 위하여 이용됩니다. 갈색 공차의 막대는 이미지의 채우기 색상의 채도를 조정하는 데 사용됩니다. 조정 후 이미지의 결과는 원래의 이미지와 일치해야 합니다.</li>
	<li>점수 수준을 조정하여 원본 이미지와 유사한 동그라미 영역의 염색 강도를 만듭니다. 참고: 다크 브라운은 강한 긍정을 나타내고, 갈색 노란색은 적당히 긍정적이고, 밝은 노란색은 약하게 양수이고, 흰색은 음수입니다.</li>
	<li>모델을 파일로 저장하고 이름을 지정합니다. 모델을 다른 슬라이드에 적용하고 선택한 어노미"를 선택합니다.</li>
	<li>소프트웨어가 이미지의 동그라미 영역에 대한 H 점수를 자동으로 계산하도록 합니다.</li>
</ol>4. H 점수 시스템을 사용하여 점수의정량화 9,10
<ol><li>면역 염색의 백분율과 염색 강도를 계산합니다 (0 : 음수, 1 +: 약한, 2 +: 보통, 3 +: 강한).</li>
	<li>점수 매기기 시스템(H-score)을 사용하여 종양 및 인접한 비종양 부위의 병리학적 점수를 계산합니다. 참고 : H 점수 = (약한 강도x 1) + (중간 강도x2) + (강도가 강한 세포의 % x 3). 따라서, 최대 H 점수는 세포의 100%가 강한 강도로 정량화되는 경우 300이다.</li>
</ol>

<ol><li>Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terf%2FTRIM17+stimulates+degradation+of+kinetochore+protein+ZWINT+and+regulates+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation.</a> The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).</li>
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<li>Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hec1+sequentially+recruits+Zwint-1+and+ZW10+to+kinetochores+for+faithful+chromosome+segregation+and+spindle+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control.</a> Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).</li>
<li>Ying, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Zwint+predicts+poor+prognosis+and+promotes+the+proliferation+of+hepatocellular+carcinoma+by+regulating+cell-cycle-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+prognostic+value+of+ZW10+interacting+protein+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).</li>
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<li>Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology%3A+current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Digital pathology: current status and future perspectives.</a> Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).</li>
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<li>Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+fully+digital+pathology+slide+archive+by+high-volume+tissue+slide+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning.</a> Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

전체 슬라이드 스캐닝은 임상 및 연구 목적으로 고품질 이미지의 강력한 스캐닝 및 생산에 대한 화제가 되고 있습니다11,12,13. 이미지는 분11,12,13이내에 슬라이드 스캐닝 현미경에 의해 생성 될 수있다. 이 방법론을 적용해서, 우리는 ZWINT IHC 슬라이드를 위한 고품질 심상을 얻고 종양과 비종양 조직 사이 H 점수를 비교했습니다. 여기에 제시된 프로토콜에서, 가장 중요한 단계는 병리학적 채점13,14 전에 고품질 IHC 슬라이드의 제조, 이미지 획득 및 종양 및 비종양 영역의 사양이...

ZW10 상호 작용 단백질(ZWINT)은 유사분열 스핀들 체크포인트1,2,3에관여하는 키네토코레 복합체의 필수 성분이다. ZWINT의 고갈은 비정상적인 조기 염색체 분리 1,2,3으로이어진다고 보고되었다. 최근 연구는 ZWINT가 종양 세포의 증식을 촉진하여 다발성 종양의 발병기전에 관여하는 것으로 4,5. 우리는 이전에 폐암에 있는 ZWINT의과발현을 보고했습니다 5. CLM을 이용한 병리학자에 의한 슬라이드 분석은 시간이 많이 소요되고 정량적이지 않다는 것이 널리 받아들여지고있다6,7,8. 또한 저장된 유리 슬라이드의 열화로 인해 이전에 생성된 슬라이드를 철회할 수 없습니다. 컴퓨터 기반의 디지털 전체 슬라이드 이미징(WSI)의 새로운 방법은이러한 한계를 극복할 수 있는 6,7,8.
이를 위해, 우리는 전체 슬라이드 디지털 스캐닝 및 소프트웨어 기반 이미지 분석과 결합된 인간 폐암 조직에서 ZWINT의 면역 염색방법론을 설명합니다. 이 방법론의 주요 장점은 CLM과 일치하는 결과를 생산하는 것입니다. 이 기술은 헤마톡실린-에오신 염색(H&E) 및 IHC, 현자 형질화(FISH), 조직 미세어레이(TMA), 약물 발견 및 개발의 병리학적 채점 분야에서 널리 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic MIDI</td><td>3D HISTECH</td><td>Cat: PMIDI-040709</td><td>12슬라이드 용량, 형광 스캐닝 등 놀라운 기능 세트를 갖춘 자동 디지털 슬라이드 스캐너입니다.</td></tr><tr><td>QuantCenter</td><td>3D HISTECH</td><td>회사 공식 웹 사이트에서 다운로드</td><td>3DHISTCH의 이미지 분석 응용 프로그램을위한 프레임 워크.</td></tr><tr><td>LEICA RM2235</td><td>Leica Microsystems</td><td>Cat: 14050038604</td><td>새로운 액세서리의 향상된 정밀도는 시편 방향뿐만 아니라 블록 대 나이프 접근에 편리함을 더할 것입니다.</td></tr><tr><td>토끼 항-인간 항-ZWINT 항체</td><td>Abcam</td><td>Cat: ab197794</td><td>인간 폐 조직에서 ZWINT의 면역조직화학 분석.</td></tr><tr><td>항토끼 2차 항체</td><td>Wuhan Goodbio Technology</td><td>Cat:GB23303-1</td><td>IHC 염색을 위한 2차 항체.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Wuhan Goodbio Technology</td><td>Cat:G0002</td><td>인산염 완충액을 함유한 용액입니다.</td></tr><tr><td>OLYMPUS CX23</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat:6M87620</td><td>H& 검출용 현미경 E 또는 IHC 슬라이드.</td></tr><tr><td>Dimethylbenzene</td><td>Shanghai Lingfeng 화학 시약</td><td>Cat:1330-20-7</td><td>현미경 연구를 위한 조직 절편 준비에서 용제 및 정화제로 사용되는 무색의 가연성 유체입니다.</td></tr><tr><td>Hematoxylin 염색 용액</td><td>Wuhan Servicebio technology</td><td>Cat:G1039</td><td>조직학 연구에 일반적으로 사용되며 세포핵을 파란색으로 착색합니다.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Baitg</td><td>Cat:2005-64-5</td><td>라우르산을 첨가하기 전에 소르비탄의 에톡실화에 의해 형성된 폴리소르베이트형 비이온성 계면활성제입니다. 그것은 약리학 적 응용 분야에서 억제제 및 유화제로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>구연산 복구 액체</td><td>Wuhan Servicebio technology</td><td>Cat:G1202</td><td>Is는 IHC 절차 중 고정 후 항원을 복구하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>라이카 ASP200s</td><td>라이카</td><td>캣: 14048043626</td><td>최대 200개의 카세트의 일상 및 연구 조직병리학을 위해 설계되었습니다.</td></tr><tr><td>라이카 Arcadia H</td><td>라이카</td><td>Cat: 14039354103</td><td>가열된 파라핀 임베딩 스테이션으로 간단한 작동과 정밀한 제어가 가능하여 품질 향상, 원활한 작업 흐름 및 신뢰성을 제공합니다.</td></tr><tr><td>라이카 Arcadia C</td><td>라이카</td><td>Cat: 14039354102</td><td>넓은 작업 표면에 60/65 이상의 카세트를 고정하는 냉각판입니다. 작동 온도가 항상 -6°C에서 안정화되도록 환경 적응형 제어 모듈로 설계되었습니다.</td></tr><tr><td>CaseViewer 소프트웨어</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 폐 조직에서 zw10 상호 작용 단백질의 면역 염색의 디지털 분석

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

이 연구의 목적은 인간 폐 조직의 면역 염색 방법론을 소개하고 전체 슬라이드 디지털 스캐닝 및 이미지 분석을 도입하는 것입니다. 디지털 스캐닝은 슬라이드 스택을 스캔하고 고품질의 디지털 이미지를 생성하는 빠른 방법입니다. 그것은 병리학자에 의해 전통적인 가벼운 현미경 검사법 (CLM)와 일치하는 결과를 생성할 수 있습니다. 또한 디지털 이미지의 가용성을 통해 여러 사람이 동일한 슬라이드를 동시에 관찰할 수 있습니다. 또한 슬라이드의 디지털 이미지를 데이터베이스에 저장할 수 있어 유리 슬라이드의 장기적인 열화를 피할 수 있습니다. 이 기술의 한계는 다음과 같습니다. 첫째, 고품질의 준비 된 조직과 원래의 면역 조직 화학 (IHC) 슬라이드가 손상또는 과도한 밀봉 잔류물없이 필요합니다. 둘째, 종양 또는 비종양 부위는 채점 하는 동안 종양 또는 비 종양 영역에 대한 혼란을 피하기 위해 소프트웨어를 사용하여 분석하기 전에 숙련 된 병리학자가 지정해야합니다. 셋째, 작업자는 전체 슬라이드 이미징에서 디지털화 프로세스 전반에 걸쳐 색상 재현을 제어해야 합니다.

우리는 IHC에 의하여 14개의 편평상피세포 암 (SCC) 및 14선암 (ADC)을 포함하여 비소세포 폐암 (NSCLC) 견본 (종양 및 인접한 비종양 조직)의 28 쌍에서 ZWINT의 발현 수준을 측정했습니다. 슬라이드의 전체 슬라이드 디지털 스캐닝은 고품질의디지털 이미지를 제공했습니다(그림 1A). 결과는 폐암의 H 점수가 인접한 비암 조직(P&lt; 0.0001, 2꼬리 t-시험)보다유의히 높았다는 것을 보여주었다(도1A 및 1B). 또한 SCC에서 ZWINT의 발현 수준이 ADC(그림 1C)보다 훨씬 높다는것을발견했습니다.
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ZW10 상호 작용 단백질 (ZWINT)은 유사분열 스핀들 체크포인트 및 암종의 병인에 참여합니다. 여기에서, 우리는 인간 적인 폐암 조직에 있는 ZWINT의 면역점의 방법론을 소개하고, 전체 슬라이드 및 심상 분석의 디지털 스캐닝에 선행합니다. 이 방법론은 고품질의 디지털 이미지와 신뢰할 수 있는 결과를 제공할 수 있습니다.

인간 폐 조직에서 ZW10 상호 작용 단백질의 면역 염색의 디지털 분석

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

이 방법은 병리학 및 면역 조직 화학의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 충분히 빠르며 고품질의 디지털 미디어를 생성한다는 것입니다. 먼저 3-3센티미터 쿵 조직 샘플을 실온에서 24시간 동안 4%의 파라포름알데히드에 고정합니다.다음 날, 실온에서 상승 에탄올 몰입에 조직을 탈수, 치료 당 20 분 동안 100 %의 자일렌에 세 개의 몰입. 마지막 자일렌 몰입 후, 30 분 동안 63도 섭씨 파라핀에 조직을 배치하고 신선한 63도 파라핀에 두 번째 45 분 침수 한 다음 마지막 한 시간 잠복에 대한 파라핀을 한 번 더 변경합니다. 파라핀이 냉각되면 회전 식 마이크로토메를 사용하여 파라핀 임베디드 조직 샘플의 5 마이크로미터 두께의 섹션을 획득하여 밀리리터 당 20 마이크로그램당 폴리 L-리신 코팅 슬라이드의 섹션을 캡처합니다.탈왁싱을 위해 슬라이드를 섭씨 65도 오븐에 2시간 동안 넣고 디메틸벤젠에 15분 간 침수한 다음 15분 동안 100% 자일렌에 담근 다음 내림차순 에탄올 몰입 시리즈에서 슬라이드를 재수화합니다. 항원 수리를 위해 슬라이드를 항원 수리 상자에 넣고 300 밀리리터의 구연산 수리 액을 상자에 넣습니다. 상자를 전자레인지에 2분간 가열한 다음 저전력으로 가열하여 6분간 끓입니다.슬라이드가 실온으로 냉각되면 실온에서 회전 셰이커에 3개의 5분 0.01 어금니 PBS 세척으로 조직 샘플을 세척합니다. 내인성 과산화효소를 제거하려면 실온의 젖은 상자에 30 분 동안 과산화수소 3 %를 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 시연한 대로 세척하고 각 섹션의 비특이적 바인딩을 섭씨 37도에서 39분 동안 100마이크로리터100 마이크로리터로 연결합니다.다음으로, 슬라이드당 항 ZWINT 항체 100 마이크로리터를 밤새 섭씨 4도에서 분류하고 0.01 대구 PBS에서 3개의 세차재를 분류합니다. 마지막 세척 후, 37섭씨37도에서 30분 동안 적절한 이차 항체로 슬라이드를 배양한 다음 3개의 0.01 어금음 PBS 세척을 한다. 마지막 세척 후, 10 분 동안 신선한 DAB의 300 마이크로 리터에 슬라이드를 추가한 다음 실온에서 수돗물로 10 초 세척합니다.헤마톡슬린 염색 용액으로 조직을 실온에서 2분 동안 염색한 다음 수돗물로 세척한 다음, 상승에 탄올 몰입으로 조직을 다시 탈수한 다음 실온에서 자일렌에 15분 동안 침전됩니다. 마지막 100% 에탄올 침수 후, 중성 잇몸 용액에 5%자일렌의 15 마이크로리터로 섹션을 장착하고 각 조직 샘플을 커버 유리로 덮습니다. 섹션의 자동 전체 슬라이드 스캐닝의 경우 먼저 슬라이드가 실온에서 12시간 동안 건조하여 조직 샘플을 담정할 수 있도록 합니다.다음으로 자동 전체 슬라이드 스캐너에서 브라이트필드를 수동으로 선택하고 수동 스캐닝 인터페이스를 입력합니다. 슬라이드이름을 수정하고 이미지에 대한 저장소 경로를 선택합니다. 검색 영역을 설정하고 사용자 집합 임계값 옵션을 사용하여 검사 샘플을 선택합니다.임계값은 약 50이며 스캐닝 영역 확장 값은 200 마이크로미터입니다. 스캔 포커스 값을 설정하고 자동 초점 및 단일 레이어 모드를 선택한 다음 슬라이드를 워크 스테이션에 로드하고 자동 스캐닝을 시작합니다. 모든 슬라이드를 스캔한 후 나중에 분석을 위해 이미지를 저장합니다.폐 조직 섹션의 이미지를 분석하려면 조직 병리학 적 이미지 분석 소프트웨어를 열고 로컬 컴퓨터를 선택하여 스캔 데이터로 파일을 엽니다. 적절한 줌 레벨을 선택하고 Toggle 색상 Adjust를 사용하여 색상을 최적의 대비로 설정한 다음 각 이미지의 관심 영역을 원/ 이름을 지정합니다. 다음, 플러그인에서, QC를 선택합니다. 시나리오 빌더가 나타납니다.밀도 퀀트를 선택하고 감지 막대를 조정합니다. 동그라미 영역의 염색 강도가 원본 이미지와 유사할 때까지 점수 레벨을 조정하고 모델을 새 파일로 저장하고 이름을 지정한 다음 모델을 다른 슬라이드에 적용하고 선택한 별표로 선택하여 소프트웨어가 각 이미지에 대한 관심 영역에 대한 APE 점수를 자동으로 계산할 수 있도록 합니다. 비소세포 폐암 표본에서 종양및 인접한 비종양 조직의 전체 슬라이드 디지털 스캐닝은 고품질의 디지털 이미지를 생성합니다.이러한 유형의 폐암 샘플에서 계산된 APE 점수는 일반적으로 인접한 비암 조직에 대해 결정된 것보다 훨씬 높습니다. 또한, 편평형 세포 암 조직 단면에서 ZWINT 발현 수준은 자주 축종 조직 샘플에서 측정된 것보다 상당히 높은 것으로 결정된다. 이 절차를 시도하는 동안 병리학적 스캐닝을하는 동안 종양 이나 종양 부위의 고품질을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 현미경 검사법의 다른 방법은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 병리학적 스캐닝을 위한 방법이나 다른 방법도 없습니다. 이 기술이 병리학 적 스캐닝 분야의 연구자들이 연구 목적의 디지털 진단을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.paraformaldehyde와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 마스크와 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

전체 마운트에 연결된 리포터 생쥐 부 염색 현미경 및 생체 내 분석에 사용은 호흡기 정상 패터닝 기전의 분석을 용이하게한다. 여기에서 우리는 이러한 기술이 기관 개발하는 동안 Wnt 신호의 분석에 기여하는 방법에 대해 설명합니다.

실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부

인간의 수지상 세포(DC)를 포함한 폐 상주 면역 세포는 흡입된 병원체와 알레르겐에 대한 방어에 매우 중요합니다. 그러나 인간의 폐 조직이 부족하기 때문에 연구가 제한적입니다. 이 연구는 면역조직화학 및 유세포 분석을 사용하여 폐 DC를 연구하기 위한 인간 점막 기관지 내 생검을 처리하는 프로토콜을 제시합니다.

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

3Rs 원리에 비추어 호흡기 모델 동물 연구 대안으로 진화 됩니다. 특히 호흡 물질의 위험 평가 대 한 적절 한 분석의 부족이 이다. 여기, 우리는 공 수 물질의 평가 대 한 인간의 정밀 컷 폐 슬라이스를 사용 하 여를 설명합니다.

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

우리는 비브라톰과 아가로스 포매된 폐 조직을 활용하여 폐 절편을 생성하는 조직 처리 기술을 개발하여 폐 구조의 고해상도 이미지를 획득할 수 있습니다. 특정 폐 구조 마커를 사용하여 공간 단백질 발현을 관찰하기 위해 면역형광 염색을 사용했습니다.

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

이 프로토콜에서는 이미지 거주 종양 침투 CD8 T 세포 인간 폐 종양 조각 내 붙일 결합 된 항 체와 함께 표시 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 CD8 T 세포 이동의 실시간 분석을 허용 한다.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

원고는 칩 기반 디지털 PCR 분석 결과를 신선한 냉동 정상에 드문 CDH1 사본 이체 (CDH1a) 및 위 암 환자에서 얻은 종양 조직 검출을 설명 합니다.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

학습하세요 인간 폐암 조직에서 ZWINT 면역 염색 및 전 슬라이드 디지털 스캐닝 방법을. 고품질 디지털 이미지와 신뢰할 수 있는 결과를 제공하여 암 병리 연구에 활용할 수 있습니다.

인간 폐 조직에서 ZW10 상호 작용 단백질의 면역 염색의 디지털 분석

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