Name: Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a validar imunofluorescência quantitativa usando imunoblotting em linhas celulares para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido FFPE. Este método objetivo melhora o diagnóstico e a previsão de tratamentos oncológicos.

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Este trabalho foi parcialmente financiado pela Fredrick Banting e Charles Best Canadá Graduate Scholarship (A.M.).

Aprovação para usar as amostras de tecido humano primário foi obtida as Ciências da saúde e afiliado hospitais de ensino pesquisa ética Board (HSREB) na Universidade da rainha.
1. construção de um linha celular tecido Microarray (TMA)
<ol><li>Células de colheita e lavagem. Nota: Este protocolo foi testado em várias linhas celulares imortalizado estabelecidas (por exemplo, HeLa, Jurkat, RCH-ACV).<ol>
<li>Para as células aderentes, colheita aproximadamente 1,3 x 107 células quando atingem cerca de 80% de confluência. Separe células usando um reagente apropriado para essa linha de celular. Nota: O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é geralmente preferido por tripsina para reduzir o risco de degradação de proteínas de superfície. Se usando tripsina, neutralize a tripsina utilizando soro fetal bovino (FBS) imediatamente após a colheita das células.</li>
		<li>Para células de suspensão, colheita cerca de 8 x 107 células em fase de crescimento log.</li>
		<li>Colete as células colhidas/separado por centrifugação por 5 min em 225 g de x em um tubo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Decante o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x. Centrifugue por 5 min em x 225g e decante o sobrenadante. Nota: 1X PBS é composto de 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 em água destilada; ajuste o pH para 7,4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pelota-los e corrigir as células em formol.<ol>
<li>Suspenda o centrifugado no interior do tubo cônico em 10 mL de formol tamponado neutro a 10% (NBF). Nota: NBF pode ser preparado diluindo-se 1 mL de solução de formaldeído 37% em 9 mL de 1X PBS. Cuidado: Tenha cuidado ao manusear formalina e formaldeído. Use uma coifa para etapas envolvendo formalina e formaldeído.</li>
		<li>Incube as células em um roqueiro a 24 rpm na temperatura de quarto durante a noite (cerca de 17 h).</li>
		<li>Prepare uma solução de 1% de agarose de baixo ponto de fusão em PBS (0,01 g de agarose por 1 mL de PBS).<ol>
<li>Prepare-se para 500 µ l da solução de agarose, por exemplo de linha de celular.</li>
			<li>Dissolva o agarose em um 80 ° C água banho ou calor bloco, com ocasionais de mistura para 2-5 min. Uma vez dissolvido, manter a solução em um bloco 37 ° C de água banho ou calor para evitar o endurecimento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pellet de células fixas do passo 1.2.2 a centrifugação por 5 min em 225 g. x remover o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de PBS 1x.</li>
		<li>Transferi as células em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e pelota por centrifugação por 5 min em 290 x g. aspirado de fora todo o sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Converter células em agarose.<ol>
<li>Adicione ~ 500 µ l de solução de agarose 1% (da etapa 1.2.3) para cada tubo contendo as células. Suavemente, mas rapidamente, pipete mistura acima e para baixo usando uma micropipeta P-1000 para misturar. Nota: Corte a extremidade da ponta da pipeta para ampliar a abertura e evitar a formação de bolhas. Manter a solução de agarose trabalhando em banho de água a 37 ° C para evitar o endurecimento.</li>
		<li>Permitir que a solução de agarose-célula a endurecer (5-10 min) à temperatura ambiente. Adicione 1 mL de 10% NBF para cada microcentrifuga tubo contendo uma amostra e manter à temperatura ambiente até parafina incorporação (até 24 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a ficha de agarose para a incorporação de parafina.<ol>
<li>Aspire fora o NBF da amostra.</li>
		<li>Retire a ficha da célula usando uma lâmina de barbear para cortar o tubo microcentrifuga, coloque a tomada dentro de tecido plástico. Armazenar fitas em 10% NBF em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Processar as amostras durante a noite ou manualmente ou usando um processador de tecido automatizado e incorporar em cera de parafina usando métodos padrão de histologia. Nota: Ver Fischer et al. 19 para um protocolo de exemplo.</li>
	<li>Usando um especializados "arrayer de tecido" instrumento, colheita duplicados núcleos de 0,6 mm de parafina bloqueiam de cada linhagem celular e insira-os, nas linhas, um bloco de parafina destinatário vazio a fim de criar uma linha de celular TMA. Nota: Os métodos padrão devem ser usados como os descritos em Fedor e De Marzo20.</li>
	<li>Incorpore os núcleos de amostras primárias, representando 2-3 tipos de tecido adicional (por exemplo, tonsila, cólon, testículos, etc.) como controles positivos ou negativos para o TMA. Escolha os tecidos que são apropriados para a proteína de interesse.</li>
	<li>Use um micrótomo para preparar dois cortes histológicos, aproximadamente de 4 a 6 µm de espessura, da linha celular TMA. Montar a seção em um slide de histologia, secá-lo e deparaffinize (conforme descrito em Fedor e De Marzo20).</li>
</ol>2. amostra de coloração por imunofluorescência
<ol><li>Otimize a diluição do anticorpo primário. Nota: Os protocolos padrão existem para a otimização de IHC ou se para seções de tecido FFPE tais como em Kajimura et al 21. um breve panorama da abordagem é descrito aqui.<ol>
<li>Prepare diluições de 4-5 de anticorpo primário para a proteína de interesse guiado pelas instruções do fabricante.</li>
		<li>Identifica um tipo de tecido do controle de fonte animal ou humana que expressa a proteína de interesse em populações de células morfologicamente reconhecíveis. Preparar as seções do tecido e montá-los em um slide, seguindo o procedimento padrão imuno-histoquímica como Fedor e De Marzo20. Nota: O número de seções necessárias é o número de diluições de anticorpo primário, mais um extra.</li>
		<li>Usando um sistema automatizado ou manual para o immunohistology, teste as diluições de anticorpo primário da etapa 2.1.1 cada em um slide da etapa 2.1.2. Omitir a aplicação de anticorpo primário de slide extra e usá-lo como um controle negativo.</li>
		<li>Durante o processo de coloração, manche todas as lâminas com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como um corante de contraste nuclear e um anticorpo secundário fluorescente etiquetado. Se maior sensibilidade for necessária, use um HRP (peroxidase de rábano silvestre)-conjugado anticorpo secundário e o sistema de amplificação de sinal com base em tyramide (veja pilha et al 13). Nota: Quando os anticorpos primários de multiplexação, uma etiqueta fluorescente diferente é usada para cada proteína.</li>
		<li>Digitalizar slides immunostained usando um instrumento adequado capaz de gerar um arquivo de imagem digital, usando a excitação e deteção comprimentos de onda adequados para o fluorophores que foram usados.</li>
		<li>Use o software apropriado para visualizar as imagens digitais e escolha empiricamente a diluição do anticorpo primário que otimiza a intensidade de sinal em relação à fluorescência de fundo. Nota: Se desejado, essa otimização pode ocorrer usando um anticorpo secundário conjugado HRP, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) e microscopia brightfield.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute se coloração sobre a linha de celular TMA.<ol>
<li>Use um sistema automatizado ou manual para o immunohistology para manchar um slide da linha celular TMA com a diluição de anticorpo primário otimizado (conforme determinado na etapa 2.1). Omitir a aplicação de anticorpo primário do segundo slide e usá-lo como um controle negativo.</li>
		<li>Durante o processo de coloração, manche todas as lâminas com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como um corante de contraste nuclear e um anticorpo secundário e tyramide como na etapa 2.1.4.</li>
		<li>Digitalizar slides immunostained usando um instrumento adequado capaz de gerar um arquivo de imagem digital, usando a excitação e deteção comprimentos de onda adequados para o fluorophores que foram usados.</li>
		<li>Use um pacote de software de análise de imagem para identificar o compartimento celular de interesse (ou seja, citoplasma e núcleo) e quantificar a intensidade de fluorescência média (IFM) para cada linha de celular. Nota: Vários pacotes de software podem ser usados para essa finalidade, e muitos são discutidos em pilha et al 13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. quantitativo Immunoblotting de linhas celulares
<ol><li>Prepare lysates de células.<ol>
<li>Colheita 2 milhões de células de cada linha de celular, como descrito nos passos de 1.1.1 a 1.1.3.</li>
		<li>Gire as células para baixo por 5 min a 650 x g em um tubo cónico de 50 mL. Decante o sobrenadante.</li>
		<li>Lavam-se células com 10 mL de PBS gelado. Resuspenda em 1 mL de PBS gelada e a transferência para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Centrifugue conforme passo 3.1.2, decantar e deixar as células no gelo.</li>
		<li>Adicionar cerca de 200 µ l de tampão de Lise radioimmunoprecipitation frio (RIPA) com inibidores de protease (10 µ l de inibidores de X 100 / mL de tampão de Lise RIPA) para as células, vórtex e incubar no gelo por 15 min. Nota: A quantidade de tampão de Lise necessário para lise eficaz varia conforme a linha celular e pode ser determinada empiricamente. O amortecedor de RIPA é composto por 150 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% de sódio Deoxycholate do, SDS 0,1% em água destilada.</li>
		<li>Para garantir o mesmo relativamente a carregar sobre o immunoblots, quantificar a proteína total em uma amostra de 20 µ l de cada lisado usando um método apropriado, tais como o ensaio de Bradford. Adicionar cerca de 40 µ l de tampão de Lise X Laemmli 6 que o restante (aproximadamente 180 µ l) de cada lisado celular e ferve a 100 ° C em um banho de água ou bloco térmico por 5 min. Nota: 6 X Laemmli reserva é composta de 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (p/v) SDS, 60% de glicerol, 0,6% (p/v) de bromofenol, 50mm ditiotreitol (DTT) em água destilada.</li>
		<li>Armazene as amostras a-20 º C por até duas semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute um immunoblot de todas as linhas de células para determinar qual linha celular tem a mais abundante proteína do interesse. Nota: Siga o procedimento descrito em Marques, T. e Yang, PC. 22, com as seguintes modificações.<ol>
<li>Alíquota de células lisado (preparado no passo 3.1) contendo 10-50 µ g de proteína (dependendo da abundância da proteína de interesse) para tubos de microcentrifuga. Adicione 2,5 µ l de 6 X Laemmli buffer e suficiente do lysis RIPA tornar-se o volume até 15 µ l.</li>
		<li>Carregar um 5% de empilhamento e uma concentração adequada resolução (por exemplo, 10% para proteínas entre 15-100 kDa) gel de SDS-PAGE com uma escada de proteína e as amostras da etapa 3.2.1. Carrega 1 buffer de X Laemmli em poços vazios. Execute o fornecimento de energia em configurações apropriadas, normalmente 125 V, para 80 min ou até que o corante azul de bromofenol atinge o fundo do prato.</li>
		<li>Executar uma transferência de proteína semi-seca, conforme descrito no Wiedemann et al . 23. Nota: para os resultados representativos, uma membrana de nitrocelulose (que não precisa ser embebido em metanol), e buffer de transferência frio Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) foram utilizados. Buffer de BSN é composta de 48 mM Tris, glicina de 39 milímetros, 20% de metanol em água destilada.</li>
		<li>Após a transferência, use uma lâmina de barbear para cortar a membrana horizontalmente para separar a porção que contém a proteína de interesse de uma proteína de controlo interno apropriado, como GAPDH.</li>
		<li>Proceda à incubação do bloqueio e anticorpo usando o tampão de bloqueio recomendado pelo fabricante dos anticorpos primários. Nota: As diluições de anticorpo primário podem variar dramaticamente dependendo da sensibilidade e da abundância de proteína. Para os resultados representativos abaixo, o anticorpo à proteína de interesse necessário uma diluição de 1:1,000 enquanto o controle GAPDH necessária uma diluição de 1:40,000. A diluição de anticorpos secundários usado foi de 1:3, 000.</li>
		<li>Após a incubação do anticorpo e lavagem da membrana, coloque as tiras de membrana em uma bainha de plástico transparente como um saco de sanduíche.</li>
		<li>Prepare a mistura de quimioluminescência (ECL) de enchanced seguindo as instruções do fabricante. Use uma pipeta P-1000 para cobrir a membrana com a mistura de ECL, fechar a bainha e incubar as tiras de membrana com a mistura no escuro à temperatura ambiente por 1-2 min.</li>
		<li>Lugar da bainha da membrana em uma plataforma digital de imagem. Uso da quimioluminescência e deteção de marcador colorimétrico para capturar várias exposições da membrana. Nota: Tempos de exposição irá variar com base na quantidade de proteína carregada, abundância de proteína alvo, afinidade do anticorpo etc começar com uma exposição automática (normalmente alguns segundos) e teste de tempos de exposição acima e abaixo por incrementos de alguns segundos.</li>
		<li>Empiricamente, ou usando o software de análise de imagem, determinar qual linha celular expressa mais proteína do alvo.</li>
	</ol></li>
	<li>Encontre a gama dinâmica linear de cada anticorpo primário usando uma diluição de série.<ol>
<li>Executar etapas 3.2.1-3.2.8 usando uma série de diluições de série da linha celular que expressa a maior concentração da proteína alvo (identificada na etapa 3.2.9).</li>
		<li>Use o software de análise de imagem como o ImageJ para realizar densitometria sobre as imagens da exposição.<ol>
<li>Por exemplo, usando o ImageJ, use a ferramenta de Seleção retangular para selecionar a primeira pista do gel para quantificar. Ir para analisar | Géis | Selecione a primeira pista. Use o mouse para mover o retângulo resultante para a próxima pista. Ir para analisar | Géis | Selecione próximo Lane. Repetidamente mover o retângulo para a pista ao lado e selecione a pista para o restante das pistas.</li>
			<li>Ir para analisar | Géis | Plotar rotas. Use a ferramenta de Linha reta para desenhar linhas entre as bases de cada pico para remover o ruído de fundo. Use a ferramenta varinha para selecionar cada pico e recolher a densidade de cada pico, doravante referida como a intensidade da banda, da janela de resultados .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use a densitometria saída para criar um gráfico de dispersão da banda intensidade versus a quantidade de proteína total carregado para cada anticorpo primário. Usando uma linha de melhor ajuste e inspeção visual, determine a localização (escala de intensidade) da gama dinâmica linear de cada anticorpo.</li>
		<li>Escolha uma concentração de proteína que gera um valor na extremidade superior do intervalo linear para ser a concentração de seguir em frente com todas as linhas de célula. Nota: Uma vez que esta concentração é abaixo do nível de saturação na linha de celular com a maior quantidade desta proteína, não deve haver nenhum perigo de sobre expondo as bandas para as outras linhas de célula.</li>
	</ol></li>
	<li>Executar um immunoblot usando a concentração de proteína escolhida na etapa 3.3.4 para todas as linhas de célula e repita etapas 3.2.1-3.2.8.<ol>
<li>Realize densitometria nos exames Digitas como na etapa 3.3.2. Escolha as imagens de exposições que geram sinais dentro das escalas lineares para cada anticorpo identificado na etapa 3.3.3.</li>
		<li>Usando os sinais de intensidade de banda partir da 3.4.1 os riscos ideais, calcule a relação de intensidade de banda de proteína alvo de intensidade de banda controle para cada linha de célula de carga. Esses valores de relação indicam a abundância relativa da proteína alvo de interesse.</li>
		<li>Executar um teste de correlação de Pearson (pode ser feito usando um pacote de software estatístico) para correlacionar os valores obtidos da análise de imagem do se coloração (passo 2.2) àqueles obtidos de immunoblotting (etapa 3.4.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Descrevemos um método que faz uso de immunoblotting quantitativa (IB) para demonstrar a utilidade da imunofluorescência (IF) para determinar a abundância relativa de uma proteína do alvo em amostras de tecido FFPE. Métodos de quantificação da proteína atual são limitados pela sua natureza categórica, como cromogênico IHC32,, ou pela necessidade de homogeneizar as amostras, impedindo a investigação sobre as populações de estrutura e célula de amostra, tais como co...

A necessidade de quantificar proteínas no formalin-fixas, parafina amostras de biópsia de tecido (FFPE) existe em muitos campos clínicos. Por exemplo, quantificação de proteínas biomarcador em espécimes de biópsia de rotina é usada para elucidar o prognóstico e informar o tratamento para pacientes de câncer1. No entanto, métodos atuais são tipicamente subjetivos e faltam de validação.
Imuno-histoquímica (IHC) é usado rotineiramente em laboratórios de patologia e geralmente depende de um anticorpo primário dirigidas a proteína do alvo e um anticorpo secundário conjugado com um rótulo enzimático, tais como a peroxidase de rábano2. IHC convencional é sensível, pode fazer uso de minuto amostras e preserva a integridade morfológica de amostras de tecido, permitindo a avaliação da expressão da proteína dentro de seu contexto histológico relevante. No entanto, porque o cromogênico sinal gerado pelo IHC é subtrativo, sofre de uma faixa relativamente estreita dinâmica e oferece um potencial limitado de multiplexação de3,2,4. Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI-MSI) de imagem preserva a integridade morfológica. No entanto, esta tecnologia em desenvolvimento é associada com a modesta resolução morfológica e requer calibração significativa e normalização, prejudicando sua viabilidade para uso clínico rotineiro5,6,7. Técnicas alternativas para quantificar proteínas em amostras de tecido incluem immunoblotting8, espectrometria de massa9,10,11e enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)12, cada de que começa com um homogeneizado lisado de tecido de amostra. Amostras de tecido primário são heterogêneas em que eles contêm uma infinidade de tipos de células. Portanto, técnicas que impliquem a homogeneização das amostras não permite a quantificação de uma proteína em uma população de célula específica de interesse, tais como células cancerosas.
Como IHC, se é aplicável às pequenas FFPE amostras e permite a manutenção da integridade histológicas13. No entanto, graças à natureza aditiva de sinais de fluorescência, se é passível de aplicação de vários anticorpos primários e etiquetas fluorescentes. Assim, uma proteína de interesse pode ser quantificada relativamente dentro de células específicas ou compartimentos celulares (por exemplo, núcleo e citoplasma) definidos usando outros anticorpos. Sinais de fluorescência também têm a vantagem de uma maior gama dinâmica13,14. A superioridade, reprodutibilidade e multiplexação potencial de se aplicado a amostras FFPE tem sido demonstrada13,14,15.
Neste documento descrevemos o uso de quantitativo immunoblotting utilizando linhagens celulares estabelecidas como padrão ouro para apurar a natureza quantitativa de se juntamente com a análise de imagem computadorizada na determinação da abundância relativa de uma proteína de interesse em cortes histológicos de amostras de tecido FFPE. Nós aplicamos esse método com êxito em uma abordagem multiplex para quantificar proteínas biomarcador em amostras de biópsia clínico16,17,18.

<table><tbody><tr><td>697</td><td>DSMZ</td><td>ACC 42</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>RCH-ACV</td><td>DSMZ</td><td>ACC 548</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ</td><td>ACC 342</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>REH</td><td>DSMZ</td><td>ACC 22</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>Raji</td><td>Linha celular ATCC</td><td>CCL-86</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>Linha celular ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina / EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>R001100</td><td>Para separar células adesivas</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Wisent Inc.</td><td>81150</td><td>Para neutralizar a tripsina</td></tr><tr><td>Neutro Tamponado</td><td>Formalina Protocolo</td><td>245-684</td><td>Para fixação de pellets de células</td></tr><tr><td>UltraPure baixo ponto de fusão agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td>Para pellets de células de fundição</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo Bcl-2 anti-humano, clone 124</td><td>Dako (Agilent)</td><td>cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td><td>Para detectar Bcl-2 por imunofluorescência e immunoblot (lote#:&nbsp; 00095786</td></tr><tr><td>Ventana Discovery XT</td><td>Roche-Para</td><td></td> <td>automação da coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Sistema EnVision+ - Polímero marcado com HRP (anti-mouse)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4000</td><td>Para amplificação de sinal de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Sistema EnVision+ - Polímero marcado com HRP (anti-coelho)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4002</td><td>Para amplificação de sinal de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Cianina 5 reagente de tiramida</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL745001KT</td><td>Para amplificação de sinal de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Aperio ImageScope</td><td>Leica Biosystems-Para</td><td></td> <td>visualizar lâminas digitalizadas</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem HALO</td><td>Indica Labs-Para</td><td></td> <td>quantificação de inibidores de protease de imunofluorescência</td></tr><tr><td>(coquetel de inibidores de protease Halt, 100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td>Para adicionar a Tampão RIPA</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>BioShop</td><td>EDT001</td><td>Para tampão RIPA</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>BDH Limited</td><td>56009</td><td>Para tampão RIPA</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Para tampão RIPA</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>FisherBiotech</td><td>BP229</td><td>Para tampão Laemlli</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>BioShop</td><td>BRO777</td><td>Para tampão Laemlli</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>Para tampão Laemlli</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB001</td><td>Para lavagens de immunoblot</td></tr><tr><td>Escada de proteína (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td>Para gel de proteína em execução</td></tr><tr><td>Papel de filtro (papel de borrão extra grosso)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703969</td><td>Para blotting transferência</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td>Para transferência de transferência</td></tr><tr><td>Trans-blot SD célula de transferência semi-seca</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Para transferência semi-seca</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado (leite em pó desnatado)</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9999S</td><td>Para bloqueio</td></tr><tr><td>de tampão Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Para tampão de lavagem</td></tr><tr><td>GAPDH coelho anticorpo monoclonal</td><td>Epitomics</td><td>2251-1</td><td>Anticorpo primário da proteína de controle (lote#: YE101901C)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo IgG de cabra (conjugado com HRP)</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td><td>Anticorpo secundário para imunotransferência</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG de cabra anti-coelho (conjugado com HRP)</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td><td>Anticorpo secundário para immunoblot (lote#: GR3192725-5)</td></tr><tr><td>Clarity Western Substratos ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Para detecção de sinal de immunoblot</td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29083461</td><td>Para detecção de sinal de immunoblot</td></tr><tr><td>Software</td><td>ImageJ Freeware, NIH-Para</td><td></td> <td>análise de densitometria</td></tr></tbody></table>

immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantificação de proteínas de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE) é importante na clínica e aplicações de pesquisa. Um método ideal de quantificação é exato, tem uma ampla gama de dinâmica linear e mantém a integridade estrutural da amostra para permitir a identificação dos tipos de células individuais. Métodos atuais como imuno-histoquímica (IHC), espectrometria de massa e immunoblotting cada um não cumprem estas estipulações devido à sua natureza categórica ou necessidade de homogeneizar a amostra. Como um método alternativo, propomos a utilização de análise de imagem para determinar a abundância relativa de uma proteína de interesse em tecidos FFPE e imunofluorescência (IF). Neste documento vamos demonstrar que este método é facilmente otimizado, produz uma ampla faixa dinâmica e é linearmente quantificável em comparação com o padrão-ouro de immunoblotting quantitativa. Além disso, este método permite a manutenção da integridade estrutural da amostra e permite a distinção de vários tipos de células, que pode ser crucial em aplicações diagnósticas. Globalmente, este é um método robusto para a quantificação relativa de proteínas nas amostras FFPE e pode ser facilmente adaptado para atender clínicas ou as necessidades de investigação.

Este protocolo foi utilizado para confirmar a capacidade de se determinar a quantidade relativa da proteína anti apoptótica Bcl-2 em linha de celular feita em blocos de tecido FFPE. Bcl-2 quantificando seletivamente nas células cancerosas pode elucidar mecanismos oncogênicos e pode ser útil no diagnóstico patológico e em informar as decisões de manejo clínico24. Mais especificamente, Bcl-2 desempenha um papel no desenvolvimento de linfócitos adequado, e a sua expre...

Nós descrevemos o uso de immunoblotting quantitativa para validar a histologia de imunofluorescência, juntamente com a análise de imagens como meio de quantificar uma proteína de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE). Nossos resultados demonstram a utilidade da histologia de imunofluorescência para determinar a quantidade relativa de proteínas biomarcador em amostras de biópsia de rotina.

Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da patologia do câncer, quantificando proteínas biomarcadores de material de biópsia rotineiramente processado. As principais vantagens dessa técnica em relação à imunohistoquímica convencional, são que ela é objetiva, tem uma ampla gama dinâmica e permite a quantificação de proteínas em tipos de células específicas. A presença ou ausência de certas proteínas biomarcadoras, ou mais particularmente, a abundância relativa dessas proteínas em amostras de biópsia do câncer pode ser muito útil para fazer um diagnóstico patológico específico de tipos específicos de cânceres.Mas também pode ser útil para prever a resposta aos tratamentos oncológicos, por isso essa técnica é relevante tanto para o diagnóstico quanto para o tratamento de pacientes com câncer. Este protocolo é principalmente sobre como usar a quantificação proteica em linhas celulares imortalizadas para validar a natureza quantitativa do ensaio baseado em imunofluorescência. Mas é importante notar que a imunofluorescência pode ser facilmente incorporada em uma abordagem multiplexada, e aplicada a amostras de biópsia primária.Auxiliando e demonstrando esse procedimento estarão Lee Boudreau, técnico, e Shakeel Virk, diretor de operações. Ambos do Laboratório da Rainha para Patologia Molecular. Para começar, centrifugar as células previamente colhidas em um tubo cônico de 50 mililitros a 225 Gs por cinco minutos.Decante o supernasce, e resuspense a pelota de célula em 10 mililitros de PBS. Em seguida, centrífugue as células resuspended a 225 Gs por cinco minutos. Suspenda a pelota celular com 10 mililitros de 10% NBF.Em seguida, incubar as células à temperatura ambiente em um roqueiro a 24 RPMs durante a noite. Depois de consertar as células, centrifugar as células a 225 Gs por cinco minutos. Em seguida, remova o supernascer e resuspenja as células em 500 microliters de PBS.Transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, e pelota as células através de centrifugação. Então, aspirar o supernante. Adicione aproximadamente 500 microliters de 1% de solução agarose a cada tubo contendo células.Em seguida, pipete a mistura para cima e para baixo para misturar. Depois que a solução celular agarose endurecer, adicione um mililitro de 10% NBF aos tubos. Mais tarde, remova o NBF das amostras.Use uma lâmina de barbear para remover o plugue da célula e coloque o plugue em uma fita de tecido plástico. Processe amostras durante a noite com um processador de tecido automatizado. Em seguida, incorpore as amostras em cera de parafina, usando métodos de histologia padrão.Usando um instrumento de matriz de tecido, colde núcleos duplicados de 6 milímetros do bloco de parafina e insira-os em um bloco de parafina vazio. Depois disso, use um microtome para preparar duas seções histológicas da linha celular recém-criada, TMA. Em seguida, monte as seções em um slide de histologia, e desparafina-los.Primeiro, carregue os dois slides da linha de célulaS TMA em um sistema automatizado de coloração. Colora um lado com a diluição de anticorpos primários ideal, deixando o outro como um slide de controle negativo. Para ambos os slides, aplique uma contra-mancha nuclear e um anticorpo secundário.Após o processo de coloração, adicione os reagentes de amplificação do sinal de tiragem. Depois disso, escaneie os slides imunossuados usando os comprimentos de onda de excitação e detecção apropriados para os fluoroforos utilizados. Use o software de análise de imagem para identificar o compartimento celular de interesse, seja núcleo ou citoplasma, e quantificar a intensidade média de fluorescência, ou FI, para cada linha.Para determinar qual linha celular tem a maior abundância da proteína alvo, alíquotas preciosamente preparadas em tubos de microcentrifuuge. Em seguida, adicione 2,5 microliters de tampão laemly 6x e tampão de lise RIPA suficiente para levar o volume total a 15 microliters. Em seguida, carregue um gel de página SDS, com uma escada de proteína, e as amostras previamente preparadas.Depois disso, carregue o tampão laemly nos poços vazios. Execute o gel até que o corante azul atinja a parte inferior da placa. Depois de realizar uma transferência de proteína semi-seca, use uma lâmina de barbear para cortar a membrana horizontalmente para separar a proteína de interesse da proteína de controle.Realizar incubações de bloqueio e anticorpos de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, coloque as tiras de membrana em um saco plástico transparente. Use uma pipeta P1000 para cobrir as membranas com mistura de ECL.Em seguida, sele o saco e incuba as membranas à temperatura ambiente no escuro por um a dois minutos. Em seguida, coloque o saco plástico contendo as membranas em uma plataforma de imagem digital. Use a quemiluminescência e a detecção de marcadores colorimétricos para capturar várias exposições da membrana.Usando software de análise de imagem, ou observação visual, determinar qual linha celular expressa a proteína mais alvo. Após imunoblotting uma diluição serial desta linha celular, abra as imagens de exposição usando software de análise de imagem. Use a ferramenta seleções retangulares para selecionar a primeira faixa do gel.Em seguida, vá para analisar, géis e selecione a primeira pista. Repita este processo movendo a ferramenta de seleções retangulares para a próxima faixa, e vá analisar, géis e selecionar a próxima faixa. Em seguida, vá analisar, géis e faixas de enredo.Use a ferramenta linha reta para desenhar linhas através das bases de cada pico, para remover o ruído de fundo. Em seguida, use a ferramenta varinha para selecionar cada pico e obtenha a intensidade da banda de cada pico a partir da janela de resultados. Crie uma dispersão de intensidade de banda versus a quantidade de proteína total carregada para cada anticorpo primário usando a saída de densitometria.Em seguida, use uma linha de melhor ajuste e observação visual para determinar a localização da faixa dinâmica linear de cada anticorpo. Selecione uma concentração proteica que produza uma intensidade de banda dentro da faixa linear, e realize um imunoblot de todas as linhas celulares com essa concentração de proteína, como demonstrado anteriormente. Em seguida, realize a densitometria nas varreduras digitais, selecionando exposições que produzem sinais dentro das faixas lineares previamente identificadas para cada anticorpo.Depois disso, calcule a razão da intensidade da banda de proteína alvo para a intensidade da banda de controle de carga para cada linha celular. Por fim, utilize um software estatístico para realizar um teste de correlação de Pearson entre os valores obtidos a partir da análise de imagem da coloração if, e aqueles obtidos a partir da imunoblotação. Este protocolo foi usado para confirmar a capacidade do IF de determinar a quantidade relativa da proteína anti-apoptótica Bcl-2.Diferentes diluições do anticorpo primário foram testadas em tecido amígdale humano com um colorador de imunohistologia. Para este experimento, uma diluição de um a 50 foi determinada como a diluição ideal que rendeu um sinal forte com pouco ruído de fundo. Esta diluição foi usada para manchar a linha celular TMA por imunofluorescência, e a análise de imagem foi usada para quantificar o sinal citoplasmado Cy5 atribuído ao Bcl-2.Com base no imunobloto para todas as linhas celulares testadas, Granta-519 tinha a maior abundância de Bcl-2. Um imunobloto da diluição seriada de Granta-519 lysate foi então usado para encontrar o alcance dinâmico linear de Bcl-2, e controlar a proteína GAPDH. O alcance dinâmico do Bcl-2 neste ensaio variou de uma intensidade de banda de quase 0, até 7500 unidades.O alcance dinâmico do GAPDH variou de 3000 a 6500 unidades. O imunobloto foi repetido com exposições dentro dessa faixa linear. E a razão entre Bcl-2 e GAPDH foi calculada para cada linha celular.Um teste de correlação de Pearson demonstrou que as razões de intensidade da imunoblotação estavam fortemente e positivamente correlacionadas com as leituras de intensidade do IF quantitativo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de expor a membrana final por vários pontos de tempo, a fim de encontrar a exposição ideal onde todas as bandas estão dentro de suas respectivas faixas lineares. Após validar a natureza quantitativa do protocolo IF, ele pode ser modificado para multiplex IF, em amostras de tecido rotineiramente processados, a fim de responder a questões clínicas, como onde uma proteína alvo é expressa.

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Biologia

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