Name: 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 학습하세요 cytochrome bo 3의 양성자 수송 메커니즘을 전기화학 및 형광현미경을 이용한 단일 리포솜 측정법으로 연구하는 방법을. 이 기술은 호흡 사슬 효소의 실시간 활성 분석에 활용됩니다.

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저자 BBSRC (BB/P005454/1) 재정 지원에 대 한 인정합니다. NH는 VILLUM 재단 젊은 수 사관 프로그램에 의해 투자 되었다.

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저자는 공개 없다.

설명 하는 방법을 리로 재구성 될 수 있다 호흡 막 단백질에 의해 양수 하는 양성자를 공부 하는 게 적당 하다 고 quinone 풀 전자를 교환할 수 있습니다. Liposome 루멘 (그림 1A)에 pH에 민감한 (비율 계량) 염료를 사용 하 여 단일 효소 수준에서 양성자 펌프 활동을 모니터링할 수 있습니다.
방법은 전극 샘18수정 전자 교환 ubiquinone (또는 다른 퀴 논), 지질 bilayer에 통합의 능력에 의존 합니다. 샘, 수정 금 전극의 속성은 매우 구체적인. 리는 샘과 샘에 흡착 충분히 빠른 전기 화학 산화와 감소는 리에 quinone 수영장의 수 있도록 얇은 해야 필요가 있다. 중요 한 것은, 전극과 liposome 사이 상호 작용은 지질 막의 무결성을 손상 하지 않기 위하여 충분히 약한 있이 필요가 있다. 또한, 실험 시스템의 세부 사항에 따라 그것은 바람직한 ...

효소 메커니즘 및 활동에 대 한 정보는 앙상블 또는 macroscale 수준에 분자의 수백만에 수천에서 효소 인구와 측정 통계 평균을 나타내는 일반적으로 얻어진 다. 그러나 그것은 알려져 있다,, 효소 같은 복잡 한 고분자가 그들의 행동에 설명 할지도 모른다 및 앙상블 수준에서 관찰 하는 분자 메커니즘을 반드시 모든 분자에 대 한 유효 하지 않습니다. 개별 분자 가늠 자에 그런 편차는 광범위 하 게 지난 2 년간1동안 신흥 메서드의 다양 한 단일 효소의 연구에 의해 확인 되었습니다. 특히, 형광 탐지 개별 효소 활동의 효소 활동2,3 의 조사 또는 소위 메모리 효과 (낮은의 기간에 의해 성공 했다 높은 효소 활동의 기간을 발견 사용 되었습니다. 활동 및 반대로)4,5.
많은 단일 효소 연구 필요 효소 표면 또는 공간적으로 연속 관측 시야에서 충분히 긴 유지 하는 또 다른 방법은 고정에 움직일 수 있다. 리로 효소 캡슐 표면 효소 또는 단백질 단백질 상호 작용6,7인해 어떤 부정적인 영향을 방지 하면서 효소 immobilization 수 있도록 표시 되었습니다. 또한, 리 그들의 자연적인 지질 bilayer 환경8,,910단일 막 단백질을 공부 하는 독특한 가능성을 제공.
클래스의 막 단백질, 운반, 세포 막, 단백질은 지질 bilayers (예, 리)11로 재구성 하는 경우에 공부 될 수 있다 행동에 걸쳐 물질의 방향 전 연습 12,13. 예를 들어 양성자 전 좌, 간결한 및 핵 전자 수송 체인의 여러 효소에 의해 전시 ATP 합성에 사용 되는 양성자 동기 힘을 생성 하 여 세포 호흡에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이 경우에,이 과정의 상세한 메커니즘 종종 애매 남아 있지만 활동을 양수 하는 양성자 전자 전송에 결합 이다.
최근, 우리 전기 화학의 대장균 (시 토 크롬 보3) 터미널 ubiquinol 산화 효소의 단일 효소의 활동을 양수 하는 양성자를 공부와 몇 형광 검출 가능성 입증 리14재구성 된다. 이것은 E 에서 준비 하는 리의 루멘으로는 pH에 민감한 막 불 침투성 형광 염료의 캡슐화에 의해 달성 대장균 극 지 지질 (그림 1A) 단백질 양은 대부분 리 (에 따르면 포아송 분포) 없거나 하나만 재구성된 효소 분자에 포함 되도록 최적화 되었다. 시 토 크롬 보3 의 두 기판 ubiquinone 솔루션에서 리 고 (주변) 산소를 형성 하는 지질 믹스에 추가 하 여 제공 되었다. 에 리는 띄엄띄엄 6-mercaptohexanol의 자기 조립된 단층으로 덮여 반투명 최상의 부드러운 골드 전극에 흡착 됩니다. 마지막으로, 전극은 간단한 spectroelectrochemical 셀 (그림 1B)의 하단에 장착 됩니다. Quinone 풀 산화 상태의 전기 제어 수를 유연 하 게 트리거 또는 pH에 민감한 염료에 의해 양성자 전 좌 결과로 리의 루멘 내 pH 변화를 모니터링 하는 데 사용은 어떤 순간에 효소 반응을 중지 하는 효소입니다. 두 번째, 지질 바인딩된 형광 염료, 크기와 개별 리의 볼륨의 형광 강도 확인할 수 있습니다 사용 하 고 따라서 효소 양성자 펌프 활동의 정량화. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 특히 시 토 크롬 보3 분자는 양성자 동기 힘을 급속 하 게 사라지는 자연 누수 상태를 들어갈 수을 발견. 이 문서의 목표는 자세히 단일 liposome 측정의 기법을 소개 하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>6-메르캅토-1-헥산올(6MH)</td><td>시그마</td><td>451088</td><td>97%</td></tr><tr><td>8-하이드록시피렌-1,3,6-트리술폰산(HPTS)</td><td>BioChemika</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 홀더(전기화학 셀)</td><td>맞춤형</td><td></td><td>30x30x7 mm; 내경: 26 mm; 구멍 직경: 15 mm</td></tr><tr><td>보조 전극</td><td></td><td></td><td>백금 와이어</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR 화학 물질</td><td>83627</td><td></td></tr><tr><td>대장균 극성 지질</td><td>Avanti</td><td>100600C</td><td>클로로포름 25mg/mL</td></tr><tr><td>에폭시</td><td>EPO-TEK</td><td>301-2FL</td><td>저형광 에폭시</td></tr><tr><td>피지(ImageJ 1.52d)</td><td></td><td></td><td>필수 플러그인: StackReg 및 TurboReg(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td></tr><tr><td>필터 큐브("ATTO633")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>예: 620/60 nm; 디엠 : 660 nm; Em: 700/75 nm</td></tr><tr><td>필터 큐브("HPTS1")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 470/20 nm; 디엠 : 500 nm; Em: 535/48 nm</td></tr><tr><td>필터 큐브("HPTS2")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 410/300 nm; 디엠 : 500 nm; Em: 535/48 nm</td></tr><tr><td>필터 큐브("텍사스 레드")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 560/55 nm; 디엠 : 595 nm; Em: 645/75 nm</td></tr><tr><td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td>TexasRed-DHPC가 이 작업에 사용되었습니다 (&lambda; EXC 595 nm; &람다; em 615 nm)</td></tr><tr><td>형광 염료 표지 지질(FDLL)(대체)</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 633-161</td><td>ATTO633-DOPE를 대체재(&lambda; EXC 630 nm; &람다; em 651 nm)</td></tr><tr><td>겔 여과 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-33</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, 추가 단백질 정제용</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>VWR International</td><td>631-0172</td><td>No 1.5</td></tr><tr><td>Glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>1725 RNR</td><td>250 &micro; L</td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td><td>T101/V1</td><td>1.75 mL 용량</td></tr><tr><td>Gold</td><td>GoodFellow</td><td></td><td>99.99%</td></tr><tr><td>Gramacidin</td><td>Sigma</td><td>G5002</td><td></td></tr><tr><td>수은 황산염 기준 전극</td><td>복사계(해시)</td><td>E21M012</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>Minispin NL040</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Andor</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>현미경 램프</td><td>Nikon</td><td>Intensilight C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.0.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>현미경 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>n-Octyl &beta;-D-glucopyranoside</td><td>Melford Laboratories</td><td>B2007</td><td></td></tr><tr><td>Nova 1.10</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Potentiostat 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 60x/1.4 oil</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2017</td><td>OriginLab</td><td></td><td>플로팅 소프트웨어</td></tr><tr><td>O-ring (Electrochemical cell)</td><td>Orinoko</td><td></td><td>내경: 16 mm; 단면: 1.5 mm</td></tr><tr><td>플라스틱 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>폴리스티렌 마이크로비즈</td><td>Bio-RAD</td><td>152-3920</td><td>Biobeads, 20-50 mesh</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Metrohm Autolab</td><td>PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>CH Instruments</td><td>CHI604C</td><td></td></tr><tr><td>스크립팅 소프트웨어</td><td>Matlab</td><td>R2017a</td><td>필요한 도구 상자: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'</td></tr> <tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>IDB Technologies Ltd</td><td>Si-C2 (N< 100>P)</td><td>&Oslash; 25 mm, 525 um 두께</td></tr>의 <tr><td>테플론 셀 (전기화학 셀)</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>외경: 26 mm; 내경: 13.5 mm</td></tr><tr><td>템플-스트리핑 초평면 금 표면</td><td>Platypus Technologies</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td>대안적인 사용 준비가 완료된 초평면 금 표면 (필요에 따라 두께 100 nm 미만)</td></tr><tr><td>얇은 마이크로피펫 팁</td><td>Sarstedt</td><td>70.1190.100</td><td>또는 유사한 gelloader 끝 200 &micro; L</td></tr><tr><td>유비퀴논-10</td><td>시그마</td><td>C-9538</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L-80XP</td><td>(Ti 45 로터 포함</td></tr>) <tr><td>초음파 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15063</td><td></td></tr></tbody></table>

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 liposome 측정

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

전자의 양성자 펌프 효소 ATP 생산에 사용 되는 양성자 동기 힘을 만드는 막에 걸쳐 체인 몇 redox 반응 양성자 전 좌를 전송 합니다. 막 단백질의 amphiphilic 자연 그들의 처리에 특히 주의 필요 그리고 양성자 전 좌 처럼 막 전송 프로세스를 공부를 할 때 자연 지질 환경으로 재구성 불가결 하지 않습니다. 여기, 우리는 예를 들어 대장균 에서 시 토 크롬 보3 복용 막 산화 환 원 효소의 양성자 펌핑 메커니즘의 조사를 위해 사용 된 방법 선발. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법의 조합 quinone 수영장과 모니터 pH 변화는 루멘의 산화 상태를 제어 하는 데 사용 됩니다. 형광 현미경의 해상도 인해 수백 리 측정할 수 있습니다 동시에 동안 효소 콘텐츠 단일 효소 또는 liposome 당 전송 축소 될 수 있습니다. 각각 단일 효소 분석 전체 인구의 동작에 의해 그렇지 않으면 숨겨져 있을 수 있습니다 효소 기능 역학에서 패턴을 밝힐 수 있다. 우리는 자동된 이미지 분석을 위한 스크립트의 설명을 포함합니다.

6MH의 샘과 금 수정 커버 슬립 (전극)의 품질 각 전기 화학 임피던스 분광학 실험 하기 전에 검사 됩니다. 그림 2A 리 흡착 전후 전기 화학 임피던스 분광학을 사용 하 여 측정 하는 대표적인 콜 콜 플롯을 표시 합니다. 샘의 품질 충분 한 경우에, 임피던스 분광학 세미 원 콜-콜 플롯 결과 거의 순수 용량 성 행동을 보여주어야 합니다. 콜 콜 플롯에 세미 원의 지름 2.5-3.0 µ F/c m2 범위에 있어야 하는 전극 표면의 더블 레이어 커패시턴스를 같습니다. 커패시턴스 변경 해야 크게 리 흡착 시 비록 커패시턴스에 약간의 증가 (높은 리 범위, 그림 2A, 하단) 관찰 될 수 있습니다 또는 낮은 임피던스에 약간의 변화를 관찰할 수 있다 주파수 (낮은 liposome 그림 2A, 보장 ...

여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3 를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

이 방법은 자연 지질 이중 층 환경에서 시토 크롬 BO3와 같은 호흡기 막 효소의 양성자 수송 활성을 연구 할 수 있습니다. 이 단일 효소 기술의 주요 장점은 전기 화학을 사용하여 언제든지 효소 반응을 시작하고 중지 할 수있는 가능성입니다. 에스키치아 대장균추출물의 엽록소 육수 200마이크로리터를 유리 바이알로 유리 바이옴으로 유리 주사기 로 옮기는 유리 주사기 를 사용한다.지질에 1-100 유비퀴논 10의 최종 비율을 만들기 위해 밀리리터 유비퀴논 10당 1밀리그램의 50 마이크로리터를 추가합니다. 혼합물에 밀리리터 긴 파길이 형광염료 라벨이 부착된 지질 약식 FDLL당 1밀리그램의 20마이크로리터를 첨가한다. 짧은 소용돌이에 의해 클로로폼 용액을 균질화하고 부드러운 질소 또는 아르곤 흐름 하에서 대부분의 클로로포름을 증발시다.적어도 한 시간 동안 진공 상태에서 추가 증발에 의해 클로로폼 흔적을 완전히 제거하십시오. 지질 유비퀴논 10 FDLL 드라이 믹스의 알리쿼트에 40 밀리머걸러 MOPS pH 7.4 버퍼의 312.5 마이크로리터를 추가합니다. 지질 필름이 완전히 다시 중단 될 때까지 소용돌이를 혼합하고 초음파 목욕에서 치료의 2 분 다음.다음으로 25 밀리머 HPTS의 125 마이크로 리터를 추가, 리포솜 내부에 캡슐화 됩니다 pH 민감한 형광 염료. 이제 250 밀리머 OGP 계면 활성제의 137.5 마이크로 리터를 추가합니다. 소용돌이를 사용하여 혼합 한 후, 모든 지질이 계면 활성제 미젤로 용해되도록 10 분 동안 초음파 수조에서 혼합물을 초음파 처리합니다.그런 다음 분산을 1.5 밀리리터 플라스틱 튜브로 옮킨다. 필요한 양의 사이토크롬 BO3를 추가하고 초순수수를 추가하여 총 50마이크로리터를 만듭니다. 롤러 믹서에서 10 분 동안 섭씨 4도에서 재구성 혼합물을 배양합니다.다음 무게 50 폴리스티렌 마이크로 비드의 각 에 1.5 밀리 리터 튜브 캡. 그런 다음 100 밀리그램의 폴리스티렌 마이크로비드를 또 다른 두 개의 1.5 밀리리터 튜브 캡에 넣습니다. 파라핀 필름으로 캡을 닫아 건조를 방지합니다.1.5 밀리리터 플라스틱 튜브에 폴리스티렌 마이크로비드가 있는 캡을 준비된 분산과 함께 넣어 재구성 혼합물에 폴리스티렌 마이크로비드 의 첫 50 밀리그램을 추가합니다. 그런 다음 몇 초 동안 짧은 스핀을 수행하여 마이크로비드를 튜브 바닥에 가져옵니다. 폴리스티렌 마이크로비드가 계면 활성제를 30분

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에서 우리는 electrogenic 막 수송의 특성에 대한 응용 프로그램에 초점을 맞춘 견고한 지원 세포막에 따라 전기 생리학 방법을 제시한다.

전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

이 기사에서는 전자 상자성 공명 연구를 위한 5층 리간드 게이트 채널의 위치 지정 스핀 라벨링 및 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 모든 멤브레인 단백질에 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 재구성 방법은 정의된 지질 시스템에서 거시적 및 단일 채널 전류의 패치 클램프 측정에도 사용할 수 있습니다.

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

이 프로토콜은 세포 엑소사이토시스(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis) 주기 동안 지질 막 이동을 모니터링하기 위해 pH에 민감한 지질 형광단 클래스를 사용하는 형광 이미징 방법을 제시합니다.

pH에 민감한 형광 지질 아날로그 ND6를 사용한 막 지질 회전율 측정

우리는 살아있는 세포에 있는 개별 적인 macropinosomes에 있는 pH, 산화 사건 및 단백질 소화를 측정하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이중 불소 경 미세 검사법과 인구 기반 기술에 비해 제공하는 이점에 중점을 둡니까.

이중 불소공포증 비율 현미경 검사를 사용하여 매크로피노좀의 pH, 레독스 화학 및 분해 능력 측정

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

학습하세요 cytochrome bo 3의 양성자 수송 메커니즘을 전기화학 및 형광현미경을 이용한 단일 리포솜 측정법으로 연구하는 방법을. 이 기술은 호흡 사슬 효소의 실시간 활성 분석에 활용됩니다.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

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