3D анализ Мультиклеточных реакций на Хемоаттрактантные градиенты

Различия в упрощенных 2D культурах in vitro по сравнению с 3D-тканями повысили интерес к 3D-системам, представляющим пространственную и химическую сложность живых тканей. Процесс изготовления не требует методов объектной или фотолитографии. Тем не менее, 3D PDMS устройство включает в себя необходимые векторы для применения 3D физиологической среды.

Для подготовки мезофлюидных устройств используйте соответствующую трехмерную компьютерную программу для разработки маски формы для полидиметилсилоксана или устройства PDMS и распечатайте форму с помощью стереолитографического оборудования с терморезистентной смолой. Когда плесень готова, примерно смешать три миллилитров PDMS мономерного раствора на плесень с лечебным агентом в соотношении 10 к одному и использовать вакуум для дегазации смеси в вакууме desiccator в течение одного часа. В конце высыхания используйте кусок клейкой ленты, чтобы удалить пыль с поверхности формы и тщательно заполнить форму с дегазации PDMS решение.

Далее, вылечить PDMS при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух часов, прежде чем позволить плесени остыть при комнатной температуре. Когда плесень охлаждается на ощупь, используйте лезвие, чтобы сократить границу между плесенью и PDMS и тщательно очистить PDMS от плесени. Обрезать PDMS, чтобы соответствовать 22 на 22 миллиметра крышки и пробить отверстие в входе.

Используя ткани с низким содержанием ворса и 70% этанола, протрите устройство и крышки и мазок устройства с новым куском клейкой лентой, чтобы удалить любые крупные частицы пыли. Затем автоклав устройства PDMS и coverslip при 121 градусов по Цельсию в течение восьми минут мокрой и 15 минут сухой и лечения нижней поверхности части PDMS и coverslip с короной разряда пушки в течение пяти минут в ткани культуры капот перед склеиванием частей вместе. Для загрузки прибора сначала необходимо повторно использовать клетки, представляющие интерес, в соответствующем объеме среды роста, дополненной 1%пенициллином и стрептомицином и 1%инсулин-трансферрин-селений-х.

Далее смешайте 50 микролитров подвески клеток молочной железы с 425 микролитров свежеприготовленного нейтрализованного коллагенового раствора и заполните 200 микролитровую пипеткой с подвеской коллагеновых клеток. Ввишите подвеску через вход в устройство PDMS до тех пор, пока вся камера не будет заполнена и поместите устройство в инкубатор при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение одного часа, чтобы вызвать гелеобразование перед заполнением резервуаров с обеих сторон средой роста и вернуть устройство в инкубатор до конфокального изображения. Для 3D-изображения и количественной оценки установите камеру культуры визуализации живых клеток на конфокальный микроскоп и заранее установите температуру и углекислый газ до 37 градусов по Цельсию и 5% соответственно.

Добавьте воду в резервуар камеры визуализации, чтобы увлажнить камеру, по мере необходимости поместив влажные салфетки в камеру и поместите устройство PDMS в камеру. Добавьте эпидермальный фактор роста в один из резервуаров в качестве источника фактора в градиентном образовании, оставляя другой резервуар в качестве раковины для развития пространственно градуированных эпидермальных распределения факторов роста. Затем установите диапазон стека q, покрывающего объем органовоидов, представляющих интерес, и начните визуализацию.

В конце эксперимента используйте соответствующую программу анализа изображений для измерения длины и угла ветвей, простирающихся от органоидов или миграции отдельных клеток. Как в силико, так и в пробирке тесты показали формирование стабильного линейного эпидермального фактора роста градиента по всей области клеточной культуры, которые длятся около двух дней без пополнения источника или раковины резервуаров, предполагая, что эпидермальный фактор роста, 6,4 килодальтон белка, может сформировать стабильную диффузии основе градиента в коллагеновый гель подготовлен, как показано в течение относительно короткого периода времени. Органоиды молочной железы образуют несколько ветвей в присутствии пространственно равномерного 2,5 наномолярного эпидермального фактора роста без направленного смещения в течение трех дней, если эпидермальный фактор роста добавляется в линейный градиент, чтобы иметь 0,5 наномоляр на миллилитр.

Тем не менее, образование ветви отображает значительный направленный уклон. Следует отметить, что добавление ингибиторов разрыва соединения подавляет способность органоидов реагировать на градиент. РН коллагенового раствора имеет решающее значение для гелеобразования и жизнеспособности клеток.

Если коллаген не нейтрализуется перед смешиванием, жизнеспособность клеток будет низкой. Этот метод может быть расширен для размещения более реалистичного моделирования тканей и может вместить образование сосудистой сети из отдельных клеток в геле.