Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Deze geautomatiseerde workflow biedt een consistente eiwit enzymatische spijsvertering met een uitstekende reproduceerbaarheid en doorvoer. Dit verbetert de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van biomarkerdetectie, validatie en klinische toepassing door massaspectrometrie. Het voordeel van deze technologie is dat de volledige workflow kan worden voltooid voor 96 monsters in ongeveer vijf uur met intra-assay en inter-test CV van minder dan 20%voor de meerderheid van de eiwitten.

Deze nauwkeurige voorbereiding van het hoge doorvoermonster stelt ons in staat om ziekteproteooms van weefsel of biofluïden op grotere schaal te onderzoeken. Daarnaast biedt de geautomatiseerde proteomische monstervoorbereidingsworkflow een solide basis voor een hoog gehalte en een kwantitatieve proteomische analyse. Het aantonen van de procedure zal Dr.Qin Fu zijn, directeur van het High Throughput Center bij Cedar Sinai en Mr.Casey Johnson, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium.

Voeg voor het begin van de analyse vijf microliters van gepoold gezond menselijk plasma toe in een 96 ronde diepe put propyleenplaat. Wanneer alle monsters zijn geladen, opent u de software van het vloeistofhandlerapparaat en selecteert u onder het tabblad methode alle assen naar huis om de geautomatiseerde vloeistofhandler te oriënteren. Controleer of alle werkstations geen zichtbare luchtbellen bevatten en open een nieuwe methode en klik op Uitvoeren om de methode te starten.

Voer true in het invoeren van een waarde te gebruiken voor autosampler prompt om een autosampler plaat voorbereid aan het einde van de methode en klik op OK. Voer er een in het invoeren van een waarde die u wilt gebruiken voor de eerste kolomprompt en klik op OK. Voer 12 in het invoeren van een waarde in die u wilt gebruiken voor de laatste kolomprompt en klik op OK. Als een monsterplaat wordt gebruikt met monstervolumes van ten minste 20 microliter, voert u true in het invoeren van een waarde in die u wilt gebruiken voor de prompt van de monsterplaat en klikt u op OK. Volg de aanwijzingen in het venster Guided Labware Setup en klik op Doorgaan. Laad de juiste reagentia in de juiste putten en klik op Volgende. Klik nogmaals op Volgende om het geautomatiseerde vloeistofhandlerdek zoals afgebeeld uit te leggen, inclusief het reagens,-, monster- en autosamplerplaten, zes-put 90 microliter tipboxen, een lege 90 microliter tipbox en een volledige 230 microliter tipbox.

Klik vervolgens op Voltooien om de methode te starten. Bij de continue na centrifugatie prompt, haal de reactie plaat en plaats de plaat in de centrifuge. Breng aan het einde van de centrifugatie de reactieplaat terug naar zijn positie binnen de geautomatiseerde vloeistofhandler en klik op Doorgaan.

Voor vloeibare chromatografie en tandemmassaspectrometrieanalyse, los de peptiden op in een C18 2.1 bij 100 millimeter 3,5 micrometer kolom door hoge stroom hoge druk vloeibare chromatografie met een stroomsnelheid van 250 microliter per minuut en in lijn geanalyseerd op een drievoudige viervoudige massaspectrometer. Vijf minuten na het laden, equilibrate de kolom met 5%buffer B oplossing en elute de peptiden met een lineaire 5-35% gradiënt van buffer B over 30 minuten. Aan het einde van de elutie was je de kolom met 98%buffer B gedurende 10 minuten, gevolgd door een wasbeurt van vijf minuten met 5%buffer B voordat het volgende monster wordt geladen.

Voor de online omleiding gebruikt u een schakelklep in twee fasen om het eluent na de kolom om te leiden naar afval voordat deze de ionenbron binnenkomt. Wanneer alle monsters zijn geëuterd, kunnen meerdere reactiebewakingsgegevens worden verwerkt. In deze representatieve analyse, drie beta-gal peptiden en twee albumine peptiden werden gecontroleerd van spiked beta-gal en verwerkte plasma albumine eiwitten.

De precisie van de geautomatiseerde samplepreedworkflow werd berekend als het percentage van de variantiecoëfficiënt van de totale proteomische geselecteerde reactiebewakingsworkflow minus de procentuele variantiecoëfficiënt van de vloeibare chromatografie tandemmassaspectrometrie. Zoals verwacht werden goede signaalintensiteiten waargenomen voor zowel de menselijke serumalbumine als bèta-galeiwitten. Om de precisie van de vloeibare overdrachtsstappen te controleren, kunnen stabiele peptidenormen met isotopen worden vastgesteld voor het endogene menselijke serumalbumine en exogene bèta-galeiwit in onafhankelijke reagensoverdrachtsstappen.

Om de geautomatiseerde proteomische monstervoorbereidingsworkflow te valideren, werden de intraday-coëfficiënt van variantiewaarden berekend op basis van 21 putten die op dezelfde dag zijn voorbereid. De gemiddelde intraday procent coëfficiënt van variantie voor 40 eiwitten varieerde van 4-20%Om het randeffect van de op plaat gebaseerde geautomatiseerde workflow te evalueren, kan de procentuele coëfficiënt van variantie worden berekend op basis van specifieke putten binnen aangewezen kolommen en rijen. In dit representatieve experiment waren de signaalintensiteiten van meerdere reacties in alle kolom- en rijconfiguraties vergelijkbaar met de procentuele variantiecoëfficiënt variërend van 3-22%De belangrijkste stappen zijn het correct toevoegen van een monster volgens de gewenste 96-put plaatkaart en het correct instellen van de reagensplaat volgens de instructie van de software.

Deze geautomatiseerde proteomische monstervoorbereidingsmethode stelt onderzoekers in staat om op grote schaal betrouwbare en kwantitatieve proteomische gegevens te verzamelen.