生細胞におけるフラ-2-アナログによる細胞^内Ca2+測定に関する新規ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補正法

UV励起可能な複数プローブは、自動多元音のために固有の信号汚染を有する。NADHの問題のほとんどは、複数プローブの使用を制限している。NADHから外側の蛍光を正確に補正する方法を使用して、真の、汚染されていない複数のプローブ信号を抽出する。

この手順を実証するのが、私の研究室の研究助教授であるチョン・フン・リーです。筋細胞が管の底に落ち着くようにした後、上清を吸引する。2ミリリットルの新鮮なミリモルフラ-2-FFAM希釈液を摂氏4度で60分間ラベル付けします。

インキュベーションの終わりに、上清を取り除く前に、37°Cの水浴に30分間直立した位置にチューブを置きます。その後、室温で保存するために室温培養培地を4ミリリットル加えます。その場でのイソベシティフラ-2-ffaポイント識別は、希釈された細胞を顕微鏡ステージに取り付け、細胞が底に沈むのを3分間待ちます。

NADHフリー37度のカルシウムフリー溶液を細胞培養に多用し、標的細胞を見つける。NADHフリーのカルシウムフリー溶液を再利用する前に60秒間サポニン溶液を多量に使用します。0.1ナノメートルのステップで350〜365ナノメートルの励起スキャンを使用して、450ナノメートルと500ナノメートルで発するフラ-2-ff信号を同時に測定し、NADHフリーのカルシウムフリー溶液で再使用します。

次に、カルシウムフリー条件のシグナルからカルシウム飽和溶液中のシグナルを差し引く。次に、各励起における発光の標準偏差を計算し、個々のイソベスティクス点として最小標準偏差値を示す励起波長を選択します。マルチパラメトリック測定システムを使用してバックグラウンド信号を検出し、細胞領域内の信号を補正するには、顕微鏡浴に色素のない細胞を取り付け、細胞を3分間落ち着かせる。

NADHカルシウムフリー溶液を1分間に2〜3ミリリットルで約5分間浴中に入れ、対象細胞を覆う物体フィールドを設定する。セルをフィールド外に移動した後、セルフリーウィンドウのバックグラウンド信号を測定し、オフセットとして信号を設定します。次に、セルを初期位置に戻し、セルの背景信号とセル領域を測定します。

Rファクターを計算するには、染色フリー細胞を顕微鏡に再マウントし、カルシウムフリー溶液を使用する前に、取得した細胞の背景と領域信号を使用します。細胞懸濁液をmalate溶液でプロフェッブルする前に示されたシグナルを測定します。信号を測定した後、ピルビン酸溶液で細胞を多量にし、続いて、マレートピルビン酸溶液とロテノーン溶液を用いて増殖する。

次に、各信号の傾きを計算します。ここで、ミトコンドリアカルシウムの変化を補正前後に示す。この結果は、29.6プラスまたはマイナス1.61マイクロモルのカルシウムの1マイクロモルで1.03プラスマイナス0.13マイクロモルと最大ミトコンドリアカルシウムのミトコンドリア安静カルシウム濃度を有するミトコンドリアカルシウムの実質的な変化を明らかにした。

ミトコンドリア膜貫通電位を2つのナノモルTMREの拡散でモニタリングした。ミトコンドリア電位の変化は、マイナス150ミリボルトの想定された初期ミトコンドリア膜電位に基づいて計算され、カルシウム付加に対するNADHの減少を示し、ミトコンドリア膜電位に対して負の影響を及ぼす。このミトチョンディラルpHは、カルボキシSNARF-1ローディングによって誘導されるミトコンドリアカルシウムの増加によって影響を受けなかった。

正しくないisobesticポイントは不正確なRおよびNADHの訂正をもたらす。したがって、セルフリーの背景とセル領域を常に正しく測定するように注意してください。この技術は、生物分析流出におけるミトコンドリアカルシウム動態研究を調製するために使用される。