Kulturmethoden zur Bestimmung der Grenze der Detektion und des Überlebens in Transportmedien von Campylobacter Jejuni in humanen Fäkalproben

Die Schwierigkeit der Campylobacter-Kultur hat grundlegende Studien wie die Anzahl der Bakterien, die benötigt werden, um Krankheiten zu produzieren, gehemmt. Diese kombinierten analytischen und ausgeklügelten Proben, die hier verwendet werden, können dieses Problem beheben. Diese Technik ermöglicht es, klinisch relevante Patientensymptome mit einem positiven Fäkalkulturergebnis und zum ersten Mal mit einer tatsächlichen Anzahl von Bakterien zu korrelieren.

Zu erfahren, wie viele Bakterien mit Krankheiten korrelieren, wird eine Diagnose, ein wichtiges Ziel für den Nachweis und eine solide Methode zum Vergleich von Virulenz zwischen Stämmen oder Arten von Campylobacter bieten. Campylobacter-Kultur ist einfach, aber es erfordert eine schnelle und organisierte Vorbereitung, um die quantitative Lebensfähigkeit zu erhalten. Erhebliche Sanieren ist auch notwendig, um die Campylobacter Kolonien unter konkurrierenden Fäkalien Flora auf einem Teller zu identifizieren.

Bevor Sie eine C.jejuni- oder C.coli-Kultur beginnen, ziehen Sie Handschuhe, einen Labormantel und eine Schutzbrille an und legen Sie eine Einwegschutzfolie in eine desinfizierte laminare Schutzhaube. Mit steriler Technik streifen Sie jeden hydratisierten oder aufgetauten Bakterienbestand auf eine Campylobacter-spezifische Agarplatte und legen Sie die Platte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem anaeroben Glas, das einen mikroaeroben Atmosphärengas erzeugenden Beutel enthält. 24 Stunden später, lose einen Kolben BHI-Brühe bedecken und den Kolben in ein neues anaerobes Glas mit einem Beutel legen, der eine mikroaerobe Umgebung für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius erzeugt.

Am nächsten Morgen verwenden Sie drei Milliliter der vorreduzierten Brühe und eine Impfschlaufe, um die Starterplatte der Campylobacter-Kultur zu kratzen. Die Gülle in ein steriles Rohr geben und die restlichen 97 Milliliter der vorreduzierten Brühe mit den drei Millilitern geschliffener Gülle impfen. Legen Sie die Brühe mit dem Gasbeutel in das Glas und bebrüten die Kultur bei 37 Grad Celsius und 115 Umdrehungen pro Minute auf einem schüttelnden Brutkasten für 48 bis 72 Stunden, bis die Kultur eine optische Dichte von 600 Nanometern von nicht mehr als 4 erreicht.

Um die Anzahl der Bakterien in dieser reinen Bestandskultur zu ermitteln, führen Acht 10-fache Verdünnungsserien von 100 Mikroliter Brühe in 900 Mikroliter Verdünnung. Mit sterilen Beschichtungsperlen 100 Mikroliter des einen mal 10 bis zum negativen Fünftel bis zum 10. bis zum negativen siebten Verdünnungsmittel auf doppelten vorreduzierten Campylobacter-spezifischen Platten und Etikettenplatten mit der Verdünnungskonzentration verteilen, bevor Sie die Platten in ein zweites anaerobes Glas mit einem gaserzeugenden Beutel für 48 bis 72 Stunden bei 37 Grad Celsius legen. Am Ende der Wachstumsperiode wählen Sie Platten mit 30 bis 300 Kolonien zum Zählen.

Nach der Zählung verwenden Sie die Zählungen, um die Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter der Brühekultur nach der Formel zu bestimmen. Es ist wichtig, dass die Anzahl der analytischen Kolonien genau ist, da dies alle Schritte mit spiked Fäkalienpool untermauert. Unmittelbar nach der Beschichtung für die Zählung, wie gezeigt, mischen gleiche Mengen von Brühe und Campylobacter negativen Fäkalienpool und machen neun nachfolgende zweifach Verdünnungen in negativen Fäkalienpool, Hinzufügen einer Kontrollplatte mit Brühe ohne Campylobacter in den Fäkalpool, um die Nicht-Campylobacter-Kolonien zu identifizieren.

Streifen Sie 10 Mikroliter jeder Campylobacter Stuhlverdünnung auf doppelten vorreduzierten Campylobacter-spezifischen Agarplatten und bebrüten die Platten in einem anaeroben Glas mit einem gaserzeugenden Beutel bei 37 Grad Celsius für ca. 48 Stunden. Am Ende der Inkubation betrachten Sie visuell die gestreiften Platten für Kolonien, die denen aus reinen Campylobacter-Kulturen ähneln. Um zu bestätigen, dass die Kolonien tatsächlich Campylobacter sind wählen mehrere Campylobacter wie Kolonien für Gramm Färbung und visualisieren eine dünn gestreifte Fläche durch Lichtmikroskopie mit einer Öl-Immersion-Linse gramm-negative gekrümmte, Spirale oder Zigarre kleine Bakterien zu identifizieren.

Eine negative Kontrollplatte ohne zusätzlichen Campylobacter ist wichtig, um andere Fäkalien zu identifizieren. Betrachten Sie die letzte Verdünnung, die eine visuelle Campylobacter-ähnliche gramnegative Kolonie als Grenze der Kulturerkennung enthält. Und verwenden Sie die Formel, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter der positiven Verdünnung in erfundenen klinischen Fäkalien zu berechnen.

Um die Lebensfähigkeit von Campylobacter gespeichert in Transportmedium mischen Sie einen Milliliter Campylobacter Brühe Kultur mit einem Milliliter negativer Fäkalienpool und bereiten 10 doppelte serielle Verdünnungen in negativen Fäkalpool. Verdünnen Sie jede Verdünnung im Verhältnis eins bis vier in Cary-Blair-Medium weiter und lagern Sie die 20 Verdünnungsrohre und eine Negativkontrolle in Cary-Blair-Medium in Kappenrohren bei zwei bis acht Grad Celsius für 96 Stunden. Beginnend mit der Zeit Null und alle 24 Stunden danach streifen 10 Mikroliter Aliquots jeder Verdünnung auf Campylobacter selektive Agarplatten und bebrüten die Platten bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden.

Da es keine unabhängige Methode zur Ermittlung genauer Bakterienzahlen aus Patientenproben gibt, können zwei gleichzeitige Messungen mit einem reinen Bakterienbestand durchgeführt werden. Ein Test wird für den visuellen Nachweis von Campylobacter-Kolonien aus seriellen Verdünnungen der Stockbakterien in einer Fäkalienmatrix verwendet, wodurch klinische Proben simuliert werden. Der andere Test wird analytisch verwendet, quantifizieren die Kolonie bildenden Einheiten pro Milliliter in der gleichen Bakterien-Bestandskultur für Spiking verwendet.

Ein wichtiger Parameter für den Erfolg ist die Identifizierung der punktgenauen Kolonien unter der konkurrierenden Fäkalienflora, wie diese repräsentative Platte der stacheligen Stuhlkultur zeigt. Hier können typische Daten aus sieben unabhängigen Experimenten beobachtet werden. Es reicht nicht aus, Kolonien zu identifizieren, die Campylobacter innerhalb der Fäkalienkulturen ähneln.

Alle Kolonien sollten mit Grammfleck oder fortgeschritteneren Methoden bestätigt werden. Wir verwenden einen Enzym-Immunoassay, der genauer ist als Kultur, um ungewöhnliche Arten wie C.upsaliensis oder C.lari zu erkennen, die schlecht auf Standard-Antibiotikum mit Agar wachsen. Diese Technik legt eine notwendige Grundlage für das Studium von Dingen wie der nicht-symptomatischen Beförderung von Campylobacter und ob hohe bakterielle Belastungen einen Patienten einem höheren Risiko für schwerwiegende Folgen einer Campylobacter-Infektion aussetzen.

Tragen Sie immer PSA bei der Arbeit mit Bakterien, die oft ansteckend sind und gefährlich sein können, und mit dem negativen Fäkalienpool, der unbekannte Krankheitserreger enthalten kann, selbst wenn sie von gesunden Spendern gesammelt werden.