Name: Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer het verzamelen van bevroren hersengebieden bij muizen voor hoogwaardige RNA- en eiwitextractie. Deze methode behoudt de integriteit van weefsels tijdens dissectie voor downstreamanalyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het NIH, DA043982 en DA046196.

Dieren gebruikt in deze studie werden behandeld in een ethische en humane manier zoals uiteengezet door Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en National Institutes of Health (NIH) richtlijnen.
LET OP: Alle gereedschappen en oppervlakken moeten worden gewassen met een geschikt oplosmiddel om nucleases18 te verwijderen voordat u met het werk begint.
1. Hersenen opslaan
<ol><li>Verwijder snel de hersenen van geëuthanaseerde volwassen CD1 wildtype muizen met een gewicht van ongeveer 30 g met behulp van een conventionele aanpak13 en flash-freeze gedurende 60 seconden in vloeibare stikstof of isopentane voorgekoeld met droogijs.</li>
	<li>Bewaar bevroren hersenen bij -80 °C in aluminiumfolie of conische buizen tot gebruik.</li>
</ol>2. Voorbereiding van de hersenmatrix
<ol><li>Vierentwintig uur voor het ontleden van weefsel, plaats een schone hersenmatrix (zie Tabel van materialen)op een stapel ontdooide diepvriesverpakkingen. Sandwich de zijkanten van de matrix tussen twee vriezer verpakkingen zorg ervoor dat ongeveer 0,5 cm tussen de onderkant van de scheermessleuven en de bovenkant van de gel packs (Figuur 1A). Plaats aluminiumfolie op de uiteinden om te helpen bij het koelen. OPMERKING: Bij de aankoop van een hersenmatrix, koop er een die groot genoeg is om het hele volume van de hersenen te ontleden omte geven.</li>
	<li>Plaats de doos met de hersenmatrix en vriezer verpakkingen in een -20 °C vriezer met de bovenkant op een kier 's nachts.</li>
</ol>3. Het opzetten van een bevroren glasplaat
OPMERKING: Het doel van deze opstelling is om een bevroren oppervlak voor te bereiden waarop hersensecties kunnen worden ontleed.
<ol><li>Plaats ijs in een geïsoleerde doos tot ongeveer 5 cm van de top. Plaats vervolgens een laag van 2,5 cm droogijs op het ijs en bedek met zwarte plastic platen om te helpen bij het visualiseren van het monster(figuur 1B, figuur 1C).</li>
	<li>Plaats een glazen plaat (moet gewoon passen in de opening van de doos) op de top van het plastic en plaats droogijs op de top van de plaat in de verre hoeken (Figuur 1C).</li>
	<li>Neem de bevroren hersenmatrix uit de vriezer en steek de hersenen in om cortex-side omhoog te snijden. Laat het 10 min in de doos worden gelijkgekomen.</li>
	<li>Pas de positie van de hersenen in de matrix aan met koude tangen, zodat de sagittale sinus en dwarse sinus lijn met de loodrechte groeven van het blok (Figuur 1D). Dit zal helpen zorgen voor symmetrische secties voor een gemakkelijkere dissectie. Raak tips van tangen om ijs kort te drogen om te koelen voordat u de hersenen aanpast.</li>
	<li>Zodra de hersenen in positie is, plaats een gekoeld scheermesje in de buurt van het midden en druk het mes ongeveer 1 mm in het weefsel. Voeg gekoelde messen toe aan de rostral en caudaaluiteinden om de hersenen op hun plaats te houden(figuur 2A en figuur 2B).</li>
	<li>Voeg vanaf het rostral uiteinde bladen één voor één toe, plaats ze in de sleuven en druk ze zachtjes in het weefsel ongeveer 1 mm(figuur 2B). Blijf messen met intervallen van 1 mm toevoegen en werk naar het staartuiteinde toe.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de hersenen niet verschuiven tijdens deze tijd. Line up bladen horizontaal en verticaal(figuur 2B). Om secties in breedtes van 0,5 mm te snijden, mogen low profile microtoombladen (zie Materiaaltafel)worden gebruikt. Plaats deze tussen de grotere scheermesjes(figuur 2C).</li>
	<li>Zodra de messen op hun plaats zijn, drukt u op de bovenkant van de groep met vingers, handpalm of een ander vlak oppervlak(figuur 2C, figuur 2D). Rock de groep messen langzaam van links naar rechts om ze te verplaatsen door het weefsel. LET OP: Dit kan enige tijd duren (1-2 min) en vereist geduld. Er moet weerstand zijn tegen de messen bewegen door het weefsel. Gemakkelijke toegang betekent dat de hersenen ontdooien en het blok moet worden gekoeld met droogijs.</li>
	<li>Wanneer alle bladen de bodem van de sleuven hebben bereikt, grijp aan elke kant van de groep bladen en werk vrij van de matrix door heen en weer te schommelen. LET OP: Wees voorzichtig om te voorkomen dat u zich op de scherpe randen van de messen snijdt.</li>
	<li>Zodra de groep vrij is, plaats de stapel, rostral kant omhoog, op de glasplaat (Figuur 2E). Plaats droogijs naast en/of bovenop de stapel om de monsters verder te bevriezen voor een gemakkelijkere scheiding.</li>
	<li>Plaats de stapel met scherpe randen naar beneden op de glasplaat en aparte bladen door het verschuiven van de stapel tussen duimen en vingers. De messen moeten van elkaar scheiden met secties bevestigd.</li>
	<li>Line up secties op de glasplaat van rostral tot caudal (Figuur 2F).</li>
	<li>Scheid weefsel van de messen door messen tussen de vingers te buigen, of door te scheiden met een tweede koud scheermes(Figuren 2G,2H,2I).</li>
</ol>4. Ontleden
<ol><li>Open de Allen Mouse Brain Atlas of een andere referentie en vind oriëntatiepunten die nodig zijn om gebieden van belang te identificeren. Enkele voor de hand liggende oriëntatiepunten zijn de voorste commissure, het corpus callosum, de laterale ventrikels en de hippocampus (Figuur 3).</li>
	<li>Draai de sectie om te snijden met gekoelde tangen en zorg ervoor dat de regio die op het punt staat te worden verzameld, consistent is in de hele sectie. Raadpleeg tijdens het oogsten vaak de referentieatlas om ervoor te zorgen dat de juiste ROI wordt verkregen. OPMERKING: Een vergrootglas of ontleden microscoop is vaak nuttig in dit proces. Goede verlichting is ook essentieel. Hiervoor kunnen ledlampen met een laag wattage of een koele lamp (zie Materiaaltafel)worden gebruikt.</li>
	<li>Met een schone scalpel of punch, snijd in de sectie (Figuur 4). Prechill elk gereedschap voor het snijden door het kort aan te raken op droogijs. Duw het mes voorzichtig maar stevig in het weefsel, schommelen heen en weer om de snede te maken. Duw niet te hard of het weefsel zal breken. LET OP: Gereedschappen worden na verloop van tijd opgewarmd. Licht opgewarmde messen kunnen nuttig zijn bij het maken van schone sneden en kan breken te beperken, maar wees voorzichtig om te voorkomen dat ontdooien van weefsel. Periodiek chill tools op droog ijs.</li>
	<li>Zodra een ROI is geoogst, plaats het in gelabelde, voorgekoelde 1,5 mL buizen. Bewaar geoogste weefsels bij -80 °C tot het nodig is.</li>
	<li>Verwerk bevroren weefsel dat op deze manier wordt verzameld door toevoeging van koude RIPA-buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% CHAPS en eiwitremmercocktail (zie Table of Materials))voor eiwitextractie, of een guanidiniumbevattend oplosmiddel (zie Tabel van materialen)voor RNA-extractie naar het bevroren monster en homogeniseren onmiddellijk met behulp van een glazen Dounce of mechanische homogenisator (zie Tabel van materialen). Op deze manier zijn protease- en nuclease-remmers aanwezig als het monster opwarmt om eiwit- en nucleïnezuren te beschermen tegen afbraak.</li>
</ol>

<ol><li>Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas">https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas</a> (2008).</li>
<li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930(2009).</li>
<li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Clusters%2C+Hubs%2C+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312(2016).</li>
<li>Mitulović, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+techniques+for+proteomics+analysis%E2%80%94a+short+overview+of+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269(2007).</li>
<li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAring%2C+L+%22Laser+Capture+Microdissection.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology</a>. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457(2018).</li>
<li>Björk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain%3A+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%2C+Neuromethods%22">Neuroproteomics, Neuromethods</a>. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalkovits%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 103, Academic Press. 368-376 (1983).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+4+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>RNaseZap. Ambion. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf</a> (2008).</li>
<li>Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf</a> (2016).</li>
<li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li>
<li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+biological+activities+of+28%2C000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050(2019).</li>
<li>Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf</a> (2011).</li>
<li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit werk beschrijft een techniek om kleine, specifieke gebieden van de hersenen te isoleren en tegelijkertijd de afbraak van nucleïnezuur en eiwit te beperken. Schade aan hersenweefsels gebeurt snel zodra een organisme sterft. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een snelle opbouw van extracellulaire glutamaat en de daaruit voortvloeiende excitotoxiciteit die optreedt21. Messenger RNA is bijzonder kwetsbaar voor degradatie22,23. Afbraak van e...

Dit werk illustreert de dissectie van bevroren hersengebieden voor de extractie van hoogwaardig nucleïnezuur of eiwit met behulp van een referentie, zoals de Allen Mouse Brain Atlas1, als een gids. In deze techniek worden hersenen flash-bevroren en opgeslagen bij -80 °C voor latere sectie en ontleding terwijl ze in een bevroren toestand worden gehouden. Dit proces stelt de onderzoeker in staat om een groot aantal hersenen in één sessie te oogsten en ze later te ontleden voor een nauwkeurige verzameling van meerdere hersengebieden.
De nauwkeurige verzameling van hersengebieden van belang (ROI's) is vaak nodig bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot gen- en eiwitexpressie. Terwijl farmacologie, elektrofysiologie en optogenetica kunnen worden gebruikt op wildtype of genetisch gemodificeerde knaagdieren om te helpen verduidelijken moleculaire veranderingen die ondersteunen waargenomen gedrag2,3,4, de meting van geïnduceerde veranderingen in transcriptomen en proteomen wordt vaak gebruikt om deze bevindingen te ondersteunen. Technieken zoals kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR), westelijke blotting, RNAseq5,MAPSeq6 en HPLC7 zijn robuust en relatief laag in kosten, waardoor veel laboratoria om geïnduceerde moleculaire veranderingen te bestuderen binnen kleine hersengebieden2,4,5,6.
Er zijn verschillende manieren om nucleïnezuur of eiwit uit hersengebieden8,9,10,11,12te extraheren en te zuiveren. Veel laboratoria oogsten hersengebieden door het koelen en snijden van hersenen op ijs op het moment van oogst9,13. Hoewel deze aanpak kan resulteren in hoge kwaliteit nucleïnezuur en eiwit, is het enigszins tijd-beperkt als afbraak binnen de micro-omgeving van het weefsel kan plaatsvinden bij deze temperaturen. Dit kan met name het geval zijn bij een poging om een groot aantal dieren of ROI's in één vergadering te ontleden. Het houden van monsters bevroren helpt handhaven van bieldoelmoleculen, terwijl de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te vergelijken oriëntatiepunten aan beide zijden van elke sectie in de poging om relatief zuivere monsters te verzamelen. Laser capture is een andere manier om weefsel te verzamelen voor RNA of eiwitanalyse uit hersengebieden10. Deze procedure is superieur aan mechanische dissectie in die zin dat zeer kleine en onregelmatig gevormde ROI's kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd. Echter, laser capture wordt beperkt door het gebruik van dure apparatuur en reagentia, is tijdrovend en kan ook meer vatbaar zijn voor afbraak van monsters.
Micropunch dissectie op bevroren weefsels is niet nieuw. Vroege papers van Miklos Palkovits en anderen beschrijven de basistechnieken in detail14,15. Deze presentatie volgt grotendeels het oorspronkelijke werk, met enkele verbeteringen om de efficiëntie te vergemakkelijken en de kosten van de benodigde apparatuur te verlagen. Bijvoorbeeld, hersensecties worden gemaakt in een bevroren hersenblok in plaats van op een cryostat. Dit produceert dikkere secties die het aantal secties die nodig zijn om ROI monsters te verzamelen vermindert. Deze methode ontleedt ook monsters op een bevroren glasplaat die op droogijs in een geïsoleerde doos zit. Dit levert een subvriesfase op de bank waarop u moet werken. Secties die op deze manier worden ontleed zijn gemakkelijk te manipuleren, waardoor de onderzoeker beide zijden van elke sectie kan vergelijken met een verwijzing om besmetting van regio's buiten de gewenste ROI te beperken.
Voordelen van dit protocol zijn dat 1) de hersenen wordt gehouden in een bevroren toestand gedurende het hele proces, die helpt bij het behoud van eiwitten en nucleïnezuur en geeft de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te oogsten ROI's, en 2) de benodigde reagentia zijn goedkoop en worden gevonden in de meeste moleculaire biologie labs. In dit proces worden hele hersenen in een hersenmatrix tot 0,5-1,0 mm doorsneden en op een bevroren glasplaat geplaatst die continu wordt gekoeld met droogijs. Oriëntatiepunten gevonden in de Allen Brain Atlas1 of andere hersenen atlassen16,17 worden gebruikt om gebieden van belang te identificeren, die vervolgens worden ontleed met behulp van een koude punch of scalpel. Omdat het weefsel nooit ontdooid is, leveren regio's die op deze manier worden geoogst hoogwaardige RNA en eiwit voor downstream analyses.

<table><tbody><tr><td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 505C</td><td>Cutting block</td></tr><tr><td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 705C</td><td>Cutting block</td></tr><tr><td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Dot Scientific</td><td>229443</td><td>Voor het opslaan van bevroren ROI's</td></tr><tr><td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69031-02</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69031-03</td><td></td></tr><tr><td>4-12% NuPage gel</td><td>Invitrogen</td><td>NPO323BOX</td><td>eiwitgradiëntgel</td></tr><tr><td>Bioanalyzer System</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>RNA-analysesysteem</td></tr><tr><td>Dounce weefselmolen</td><td>Millipore Sigma</td><td> D8938</td><td>Glazen weefselhomogenisator</td></tr><tr><td>Droge ijs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>Model 180</td><td>Koellamp</td></tr><tr><td>Glazen platen</td><td>LabRepCo</td><td>11074010</td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td>protease-remmercocktail</td></tr><tr><td>Laag profiel messen</td><td>Sakura Finetek USA Inc.</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>muis anti-actine antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>JLA20</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Gebruikt in de initiële RNA-zuiverheidsanalyse</td></tr><tr><td>Nr. 15 chirurgisch mes</td><td>Surgical Design Inc</td><td>17467673</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking buffer</td><td>LiCor Biosciences</td><td>927-40000</td><td>Western blocking reagens</td></tr><tr><td>Omni Tissue Master 125</td><td>VWR</td><td>10046-866</td><td>Weefselhomogenisator</td></tr><tr><td>konijn anti-KCC2 antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>94725S</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>RNA Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>73034</td><td>Gebruikt voor het extraheren van RNA uit kleine weefselmonsters</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelhandgreep</td><td>Excelta Corp.</td><td>16050103</td><td></td></tr><tr><td>Standaard scheermesjes</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Gebruikt om RNA uit weefsel te extraheren</td></tr></tbody></table>

verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Naarmate ons begrip van de neurobiologie is gevorderd, worden moleculaire analyses vaak uitgevoerd op kleine hersengebieden zoals de mediale prefrontale cortex (mPFC) of nucleus accumbens. De uitdaging in dit werk is om het juiste gebied te ontleden met behoud van de te onderzoeken microomgeving. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige, goedkope methode met behulp van middelen die direct beschikbaar zijn in de meeste laboratoria. Deze methode behoudt nucleïnezuur en eiwitten door het weefsel bevroren te houden gedurende het hele proces. Hersenen worden gesneden in 0,5-1,0 mm secties met behulp van een hersenmatrix en gerangschikt op een bevroren glasplaat. Oriëntatiepunten binnen elke sectie worden vergeleken met een verwijzing, zoals de Allen Mouse Brain Atlas, en regio's worden ontleed met behulp van een koude scalpel of biopsie punch. Weefsel wordt vervolgens opgeslagen bij -80 °C tot gebruik. Door dit proces zijn rat en muis mPFC, nucleus accumbens, dorsale en ventrale hippocampus en andere regio's met succes geanalyseerd met behulp van qRT-PCR en westerse testen. Deze methode is beperkt tot hersengebieden die kunnen worden geïdentificeerd door duidelijke oriëntatiepunten.

Om deze methode te valideren, werd de mediale prefrontale cortex verzameld uit volwassen CD1 wildtype mannelijke muizen en RNA en eiwit werden geëxtraheerd en gekarakteriseerd. RNA werd geanalyseerd door capillaire elektroforese. Gedegradeerd RNA geeft een verlies in de intensiteit van de 28S en 18S ribosomal bands en toont ook afbraakproducten als een uitstrijkje tussen 25 en 200 nucleotiden (Figuur 5A, monster 1). RNA van hoge kwaliteit toont verschillende ribosomale banden met weinig tot ...

Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools.

Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools. Omdat hersengebieden worden bevroren van de oogst door middel van dissectie, doelmoleculen worden bewaard en de onderzoeker heeft de tijd om zorgvuldig te ontleden en op te slaan regio's van belang. Het identificeren van regio's van belang kan in eerste instantie een uitdaging zijn.Met behulp van gemeenschappelijke hersenen oriëntatiepunten als ze ontstaan en wijken door de secties in relatie tot de gewenste regio's zal de identificatie duidelijk te maken. Na het verwijderen van hersenen van geëuthanaseerde volwassen CD-1 wild type muizen, flash bevriezen het weefsel voor 60 seconden in vloeibare stikstof of isopentane. Voorkoel met droogijs en bewaar het op min 80 graden Celsius.24 uur voor het ontleden van het weefsel, plaats een schone hersenmatrix op een stapel ontdooide vriezer verpakkingen. En sandwich de zijkanten van de matrix tussen twee vriezer verpakkingen ervoor te zorgen dat ongeveer een halve centimeter tussen de onderkant van de scheermes sleuven en de bovenkant van de verpakkingen te verlat

collection-of-frozen-rodent-brain-regions-for-downstream-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Micro-dissectie van hersenen van de rat in verschillende regio's is van groot belang voor de studie van verschillende neurodegeneratieve ziekten. Deze video toont micro-dissectie van de vier grote gebieden van de hersenen zijn reukorgaan, frontale cortex, striatum en de hippocampus in de hersenen van de rat verse weefsel. Nuttige tips voor snelle verwijdering van de desbetreffende regio's om RNA en eiwit afbraak van het weefsel te voorkomen worden gegeven.

Micro-dissectie van hersenen van de rat voor RNA of eiwit-extractie uit specifieke hersengebieden regio

RNA-expressieprofilering van specifieke hersenregio's bij muizen vereist een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. Hier wordt een protocol beschreven dat gebruikmaakt van zowel coronale hersensecties als microdissectie met behulp van een weefselpons. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters is verkregen, bevestigen het nut van de beschreven methode.

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

We beschrijven een rat model van post-traumatische stress-stoornis (PTSS) dat de aanhoudende veranderingen in neuro-endocriene functie en de vertraagde lange termijn, overdreven angst reactie, kenmerkend voor PTSS-patiënten laat zien. Het diermodel en de hier beschreven methoden zijn nuttig voor het correleren van biomarkers in hersenkernen, die mechanisch maar kan niet worden gemeten in patiënten met biomarkers in perifere witte bloedcellen, die kan.

Biomarkers in een diermodel voor het openbaren van Neural, hematologische, en gedragsmatige correlaten van PTSS

This video demonstrates a detailed step-by-step protocol for preparing frozen mouse brain tissue sections for downstream analyses.

Processing of a Mouse Brain for Downstream Analysis

We beschrijven het gebruik van laser vangt microdissection te verkrijgen van monsters van afzonderlijke cel populaties van verschillende hersengebieden gen en microRNA p.a.. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van Differentiele effecten van traumatische hersenenverwonding in bepaalde gebieden van de hersenen van de rat.

Stereotactische Atlas-geleide Laser vangt Microdissection van hersengebieden beïnvloed door traumatisch letsel

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Verschillende cerebellaire regio's zijn betrokken om een rol te spelen in verschillende gedragsoutputs, maar de onderliggende moleculaire mechanismen blijven onbekend. Dit werk beschrijft een methode om de cerebellaire cortex van de hemisferen, voorste en achterste gebieden van de vermis en de diepe cerebellaire kernen reproduceerbaar en snel te ontleden om moleculaire verschillen te onderzoeken door RNA te isoleren en te testen op verschillen in genexpressie.

Cerebellaire regionale dissectie voor moleculaire analyse

We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.

Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's

Hier presenteren we een geautomatiseerde methode voor semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuron nummer in de rat substantia nigra pars compacta.

Semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neurondichtheid in de substantia Nigra van knaagdiermodellen met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse

Leer het verzamelen van bevroren hersengebieden bij muizen voor hoogwaardige RNA- en eiwitextractie. Deze methode behoudt de integriteit van weefsels tijdens dissectie voor downstreamanalyses.

Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

Meer video's verkennen